高保真CRISPR/Cas9改进策略研究

来自化脓性链球菌的CRISPR-Cas9 在基础研究到临床医疗方面具有广泛的应用。然而，Cas9 的脱靶 DNA 切割限制了它的临床治疗适用性。上述问题，可通过降低Cas9核酸酶的脱靶活性和增加其特异性进行解决。在过去的几年里，高保真Cas9变体，如eSpCas9、Cas9- hf1、HypaCas9、evoCas9和Sniper-Cas9，已经通过基于结构改造和定向进化的方法开发出来⁽¹⁾。这些Cas9变体包含破坏蛋白质- DNA或RNA-DNA相互作用的突变，或破坏与DNA结合的结构域。尽管这些Cas9变体显著降低对错配的耐受，但它们靶向DNA切割的活性大大降低。因此，在保留目标编辑活性的同时提高Cas9的特异性对于探索高保真和高效的Cas9工具至关重要。

无论是在天然还是人工CRISPR/Cas系统中，Cas9蛋白都负责定位和切割目标DNA。Cas9蛋白主要有5个结构域，包括REC（REC1,REC2和REC3）、Bridge Helix、PAM 结合结构域、HNH和RuvC (图一)。REC作为Cas9最大的结构域，负责结合向导RNA（sgRNA)。富含精氨酸的Bridge Helix对于结合目的DNA后，启动切割活性至关重要。PAM结合结构域赋予PAM特异性，负责启动与靶DNA的结合。HNH和RuvC结构域是切割单链DNA的核酸酶结构域。在缺乏sgRNA条件下，Cas9蛋白保持失活状态。在工程CRISPR系统中，sgRNA由单链RNA组成，形成由一个四环和两个或三个茎环组成的T形结构，可与目标DNA序列5 '端互补。当sgRNA与Cas9结合后，可介导Cas9结构发生变化，进而激活Cas9切割活性。一旦Cas9蛋白被激活，它通过结合与其PAM序列相匹配的序列来随机搜索目标DNA ，PAM是位于与sgRNA互补区域下游一个核苷酸内的两个或三个碱基序列^{(2, 3)}。不同的Cas9变异体需要不同的PAM序列如NGG（SpCas9）和 NNGRRT(SaCas9)，当Cas9蛋白发现含有合适PAM的潜在靶序列，并且该序列可与sgRNA互补配对，Cas9将会在PAM上游3bp位置上对双链DNA进行切割。尽管与RNA沉默相比，Cas9的脱靶效应已明显降低，但仍有报道称Cas9可在非靶点位置引起大片段删除和染色质破碎，或可在错位的基因位点切割DNA双链^{(4, 5)}，由于Cas9蛋白切割目的DNA依赖于sgRNA，因此本文将重点解析如何通过改造sgRNA序列和Cas9蛋白来提高Cas9特异性。

图一、Cas9一级结构图⁽⁶⁾

sgRNA改造

传统的sgRNA序列包含与目标DNA序列互补的20个核苷酸， sgRNA GC含量，sgRNA序列偏好性，和sgRNA表达量都可影响sgRNA特异性和活性。研究表明 gRNA-Cas9的靶向特异性是由位于sgRNA 3 '端PAM基序近10 - 12bp处的种子序列决定；而该种子序列最多可容纳5个碱基错配，因此若非靶序列与sgRNA种子区同源性很接近，通常会导致脱靶效应^{(7, 8)}。目前根据sgRNA与基因组DNA的序列特征等，通过计算机方法选择合适的靶点（如合理避开GC含量较高的靶位点），控制sgRNA与目的DNA序列碱基错配数等，可获得切割效率较高脱靶性较低的sgRNA序列^{(9, 10)}。然而研究人员发现除上述因素以外，sgRNA的长度和二级结构也会对其特异性和高效性产生影响。比如，使用截短的sgRNA，如17或18核苷酸长度，可以将一些脱靶位点的发生率降低5000倍之多，而不牺牲目标基因组编辑效率⁽¹¹⁾。除缩短sgRNA的长度，D.DewranKocak发现在sgRNA的5'端添加一个发夹结构可以提高Cas9和其他Cas效应蛋白的特异性，平均提高55倍⁽¹²⁾。近期，Masaki Kawamata等发现在sgRNA的5'端添加一段胞嘧啶序列可调节Cas9的活性和特异性；例如在sgRNA的5'端添加短胞嘧啶延伸可减少Cas9对人多能干细胞中p53的激活和细胞毒性，并在保持Cas9对双等位基因编辑效率的同时增强了细胞同源性定向修复能力，而在sgRNA的5'端添加较长胞嘧啶延伸将降低Cas9靶上切割活性，但提高了单等位基因编辑的特异性和精度⁽¹³⁾。

Cas9蛋白改造

用于减少脱靶效应的策略包括Cas9蛋白工程改造、使用高特异性的天然Cas9核酸酶、gRNA设计优化和结果调整、以及与抗CRISPR蛋白或CRISPR抑制剂的联合使用。在这些策略中，直接或间接地对Cas9蛋白进行工程改造设计，对Cas9特异性的提高更为显著。目前开发高保真Cas9变体的策略可以大致分为非理性、理性或组合方法。典型的非理性策略是基于定向进化的方法，通常包括随机诱变和高通量筛选。理性设计方法是根据结构和功能信息来指导Cas9变异设计，通常通过对点突变的计算建模实现。组合策略是将定向进化与结构导向工程相结合的方式对Cas9蛋白进行改造。表一和图二总结了这些策略和代表性的Cas9变体。

对CRISPR-Cas9变异体及其产生的切割产物分析发现Cas9 RuvC和HNH结构域分别可介导非互补链和互补链的切割。由于双链切割通常导致不准确的NHEJ途径(取决于生物体、细胞类型和细胞周期的阶段)，因此单链切割(或“nick”)有利于有效的靶向替换。Cas9中一种核酸酶催化结构域的失活突变将导致Cas9只切割目标DNA的一条链。这种切割触发更精确的HDR或碱基切除修复(BER)途径。当同时使用RuvC失活的突变体Cas9D10A， 和HNH失活的突变体Cas9H840A时，与使用野生型Cas9相比，可显著降低脱靶性⁽¹⁴⁾。另外，当REC3结构域带正电氨基酸突变成丙氨酸时，会显著降低DNA与HNH和REC结构域的结合，导致Cas9更强烈地区分靶区和脱靶区；基于此通过将四个与DNA相互作用的REC3残基突变为丙氨酸(N497A/R661A/Q695A/Q926A)，产生了一个高保真的Cas9-HF1，其靶上切割与SpCas9相当，但可明显降低脱靶效率⁽¹⁵⁾。由于Cas9-HF1未能完全消除脱靶活性，研究人员进一步在体内筛选REC3突变体，并开发出另一种高度特异性的SpCas9变体，称为“evoCas9”，其保真性明显高于Cas9-HF1 ⁽¹⁶⁾。基于相似原理，张峰等通过设计两个Cas9突变体 (“K810A/K1003A/R1060”-“eSpCas9(1.0)” 和 “K848A/K1003A/R1060” - “eSpCas9(1.1)”)，该突变体可消除Cas9带正电的侧链和DNA的磷酸主链之间的非特异性结合，因此Cas9切割复合物的稳定性需要通过sgRNA和目的DNA链之间严格的沃森-克里克碱基配对实现，从而提高了特异性⁽¹⁷⁾。

图二、高保真SpCas9突变的位置⁽¹⁴⁾

除上述理性设计外，基于随机诱变加高通量筛选的非理性设计也常用于高保真Cas9的发现，Sniper-Cas9, HiFi Cas9, xCas9, SpartaCas , efSaCas9和Sniper2L等高保真Cas9相继通过细菌或酵母定向进化的方法发现。通过理性或非理性设计，目前已有多种高保真Cas9 突变体，如eSpCas9(1.1)、Cas9-HF1、HypaCas9、CevoCas95、HiFi Cas9和Sniper-Cas9，已被开发。然而，这些变体中在引入的减少脱靶切割修饰的同时也阻碍了它们的靶上切割活性。2020年Hyongbum Henry Kim组对已有的13种高保真SpCas9突变体的特异性和有效性评估发现，其不同突变体特异性高低为evoCas9>> HypaCas9 ≥ SpCas9-HF1 ≈ eSpCas9(1.1) >xCas9 > Sniper-Cas9 > SpCas9，而其相应的DNA切割活性高低为SpCas9 ≥ Sniper-Cas9 > eSpCas9(1.1)> SpCas9-HF1 > HypaCas9 ≈ xCas9 >>evoCas9。该结果进一步证实高保真Cas9是通过牺牲其有效性实现的，因此尽管我们已经成功发现了一些高保真的Cas9变体，但它们远非完美⁽²⁰⁾。2023年Hyongbum Henry Kim组通过对前期发现的高保真Sniper-Cas9 进一步通过定向进化筛选发现新的高保真酶Sniper2L，目前被认为是第一个也是唯一一个在不牺牲其靶向切割活性的情况下，依然具有高特异性的Cas9变体（图三）⁽²¹⁾。

图三、SpCas9和SpCas9变体的特异性和活性之间的关系⁽²¹⁾

总结

由于Cas9结合、识别和激活的高度动态性和复杂性，Cas9变体区分靶标位点和脱靶位点的机制以及脱靶结合和激活的机制尚不完全清楚。进一步阐明Cas9对靶标和脱靶区的作用机制对下一代高保真Cas9变体的开发至关重要。

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