CAR-NK 疗法：癌症免疫治疗领域异军突起的“新星”

近数十年来，免疫检查点阻断疗法和嵌合抗原受体 T 细胞（CAR-T）疗法是临床免疫疗法的两个里程碑式的成就，”猎药人”们前仆后继涌入这个赛道。然而，人们发现这两种疗法在大多数实体肿瘤中疗效有限，究其原因，五花八门，例如：肿瘤细胞的低抗原性、效应 T 细胞的低浸润性以及肿瘤微环境中的免疫抑制等。此外，潜在的临床副作用（如细胞因子释放综合征）和高成本也是 CAR-T 疗法临床应用面临的主要挑战。

NK 细胞是从普通淋巴祖细胞分化来的一种免疫细胞，约占外周血淋巴细胞的 5~20%。通常，NK 细胞通过 CD56 表达而非 CD3 或 TCR 共表达来识别抗原成分。根据人类 NK 细胞细胞表面 CD56 分子的密度，人 NK 细胞可被进一步划分为两个亚群，即 CD56dim 和 CD56bright，分别执行着不同的功能^【1】，CD56dim NK 细胞以杀伤功能为主，其细胞毒活性较强。CD56bright NK 细胞以分泌细胞因子为主，其细胞毒活性较低。与 T 细胞不同，自然情况下，NK 细胞主要通过非特异性机制杀死肿瘤细胞。NK 细胞在功能上类似于  CD8 + 细胞毒性 T 细胞，并通过类似的细胞毒性机制杀死靶细胞，但缺乏体细胞重排和抗原特异性 TCR，NK 细胞细胞毒活性的激活受到一系列激活和抑制信号的调控。因此，NK  细胞对靶细胞的杀伤取决于抑制信号和激活信号之间的平衡。由于减少了 KIR（killer-cell immunoglobulin-like receptor）介导的抑制，下调人类白细胞抗原 (HLA) 表达的肿瘤细胞更容易受到 NK 细胞杀伤。

被激活的 NK 细胞通过多种机制“消灭”靶细胞细胞，例如：①释放穿孔素和颗粒酶，导致靶细胞裂解或凋亡；②促进FasL表达诱导细胞凋亡；③释放 TNF-α、IFN-γ、GM-CSF 和趋化因子（例如 CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5 和 CXCL8）以募集和激活其他效应免疫细胞；④抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity ）^【2】。

截至目前，大多数报道的 CAR-NK 临床试验使用与 CAR-T 细胞相同的基于 CD3ζ 结构域和共刺激 4-1BB 结构域的 CAR 结构。但需要注意的是，自然生理条件下，NK 细胞的激活机制与 T 细胞明显不同。因此，已经尝试基于衔接分子如 DAP10、DAP12 和 2B4 构建 NK 细胞的专属 CAR。有研究报道，基于 CD3ζ 的 CAR-NK 优于含有 DAP10 的 CAR-NK，含有 DAP12 的 CAR-NK 优于含有 CD3ζ 的 CAR-NK 。含有 2B4 和靶细胞上 CD48 的 CAR-NK 细胞比含有 4-1BB 的细胞有更高的细胞毒活性、更强的肿瘤杀伤能力和更多的细胞因子分泌^【3】。

目前，临床级 NK 细胞来源较为广泛，例如外周血单个核细胞（PBMC）、脐带血 (UCB) 、CD34 + 造血祖细胞 (HPC) 、NK 细胞系（NK92 细胞系等）和诱导多能干细胞 (iPSC)等，这些来源均可提供临床细胞剂量，适用于制备 CAR-NK。

使用 NK 细胞分离试剂盒可以直接从健康捐献者的 PBMC 或 UCB 中分离原代 NK 细胞。分离的原代 NK 细胞可以被激活，用 CAR 表达载体（例如，慢病毒载体或γ逆转录病毒载体）进行基因工程改造，然后在含有细胞因子的 NK 细胞特异性扩增培养基中扩增。

NK 细胞也可以从使用细胞因子混合物培养的HPC中分化出来，由此产生的 NK 细胞经过 CAR 改造，然后在输注前在体外扩增。

因为 CAR-NK92 细胞可以在体外无限增殖，并且对反复冻融的敏感性降低。作为 NK 细胞淋巴瘤的恶性细胞，用 CAR 改造的 NK92 细胞在输注到患者体内之前须经一定剂量的辐射损伤，以防止其在患者体内恶性增殖。

最近，iPSC 已成为“现货型” CAR-NK 细胞产品的一个有吸引力的细胞来源，这归因于它们无限的增殖能力。iPSC 可以分化为 CD34 + HPC，然后分化为 NK 细胞。重要的是，iPSCs 可以用 CAR 表达载体进行基因工程改造，然后所得的 CAR-iPSCs 可以分化为 CAR-HPCs，最后分化为 CAR-NK 细胞。

相较于 CAR-T 疗法，CAR-NK 疗法具有以下几方面独特的优势：

1）由于 CAR-NK 细胞在循环中的寿命有限，因此对正常组织的靶向/脱瘤毒性风险相对较低。细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome, CRS）和神经毒性在 CAR-NK 免疫疗法中不太可能发生，部分原因是分泌细胞因子的范围不同：活化的 NK 细胞通常产生 IFN-γ 和 GM-CSF，而CAR-T细胞主要诱导细胞因子，如 IL-1a、IL-1Ra、IL-2、IL-2Ra、IL-6、TNF-α、MCP-1、IL-8、IL-10 和 IL -15，这些细胞因子与 CRS 和严重的神经毒性高度相关^【5】。

2）除了以 CAR 依赖性方式杀死肿瘤靶细胞外，CAR-NK 细胞还可以以不依赖于 CAR 的方式消除癌细胞^【6、7】。CAR-NK 可以通过不依赖于 CAR 的机制被激活，例如 NCRs（Natural cytotoxicity receptors）、NKG2D（Natural-killer Group 2 member D）、共刺激受体 DNAX accessory molecule-1 (DNAM-1, also known as CD226)和某些激活 KIR（KIR2DS1、KIR2DS4和KIR2DL4）。而且，NK 细胞可以通过 CD16 介导的 ADCC（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity） 消灭肿瘤细胞。因此，CAR 修饰的 NK 细胞即能够通过 CAR 依赖性的方式清除抗原特异性肿瘤，又能通过 NK 细胞受体依赖性机制有效根除某些不表达 CAR 靶向抗原的异质性肿瘤。

3）CAR-NK 细胞可从包括 NK92 细胞系、PBMC、UCB、HPC 和 iPSC 在内的多种临床样本或商业化细胞系获取，且 CAR-NK 细胞可以作为“现货型”细胞治疗产品。例如，同质化的 NK92 细胞系为临床应用提供了“现货型” CAR 修饰产品，而源自基因修饰的人类 iPSC 的 CAR-NK 细胞可以以同质化且规模化方式制备，并且在临床前研究中已证明其具有有效的抗肿瘤活性和增殖能力^【8】。

CAR-NK 细胞疗法作为抗癌的新型细胞免疫治疗方法具有广阔的临床应用前景。与 CAR-T 等免疫细胞疗法相比，CAR-NK 具有多种优势，但仍面临一些挑战，首先，与 T 细胞类似，只有少量 NK 细胞浸润 TME（Tumor microenvironment）。其次，NK 细胞的半衰期较短（< 10 天），表明需要重复给药才能获得持久的反应。第三，虽然同种异体供体材料，例如 PMBC、UCB、HPSC、iPSC 等，均可用，但 CAR-NK 的 NK 细胞来源、致瘤风险、标准化等问题还需进一步规划考虑好，否则将会影响其产品的商业化进程。相信随着细胞培养、基因修饰等技术的突飞猛进，会进一步推动新型 CAR-NK 细胞产品开发，逐步解决上述挑战，为癌症治疗带来新突破。