盘点2023欧洲血液协会（EHA）年会中几种新颖的CAR-T研究

2023年6月8日~11日, 第28届欧洲血液学年会（EHA）将在德国法兰克福以线上+线下的形式举行，会议由欧洲血液学会主办。作为欧洲血液学领域规模最大的国际会议，每年都有来自全球100多个国家的10000余名专业人士与会，一起分享并探讨有关血液学的创新理念及最新的科学和临床研究成果。这里将着重介绍几种新颖的CAR-T研究，希望能帮助广大学者开拓研究思路。

美国纽约，纪念斯隆凯特琳癌症中心

  背景 ：由于克隆异质性和与正常早期造血的相似性，CAR治疗AML面临疗效挑战和靶向毒性。之前提出了一种“IF-Better”门控组合（靶向CAR和协同信号），靶向ADGRE2的CAR和CLEC12A的组合CAR概念，称为ADCLEC.syn1，并通过与靶向CLEC12A特异性嵌合共刺激受体（CCR）的结合以增强CAR-T治疗AML的目的，同时保留不表达CLEC12A且ADGRE2低表达的正常造血干细胞和祖细胞（HSPC），证明了其靶向ADGRE2低下AML的潜力。在这里将在人源化小鼠模型中比较了ADCLEC.syn1与靶向CD33的传统CAR的有效性，并量化白血病和正常细胞中的靶抗原表达。

▲先前研究文章

 方法 ：对AML和造血和非造血来源的正常组织中的ADGRE2、CD33、CD123和CLEC12A进行了定量靶向表达分析。使用流式细测定了复发/难治性（r/r）AML（n=39名患者）和正常造血细胞（n=8名健康供体）中表面靶分子的数量。还使用单细胞RNAseq数据集分析了非造血细胞类型中的靶基因表达。然后将靶向ADCLEC.syn1和CD33-CAR T细胞在患者来源或人源化AML异种移植物模型中评估体内疗效相关联。

  结果  ：在富含白血病干细胞（LSC）的AML组分中，79%的患者检测到ADGRE2高表达（1.0x10³分子/细胞），87%的患者检测出CD33高表达（1.0x10³）。在健康供体骨髓来源的正常造血细胞中，ADGRE2仅在丰度较低的细胞群中检测到，而CD33在所有髓系细胞中普遍表达，高达2.4x10 ⁴分子/细胞。这引发了潜在CAR靶点“抗原库”的问题，发现ADGRE2、CD33和CLEC12A的表达仅限于血液细胞类型，而CD123也在内皮细胞中表达。

接下来，比较了ADCLEC.syn1与参考CD33-CAR在不同AML移植模式的AML异种移植物模型和人源化模型中正常旁观者细胞中的抗白血病作用。在MOLM13异种移植物NSG模型中，ADCLEC.syn1和CD33-CAR即使在每只小鼠2x10 ⁵ CAR-T细胞的单次低剂量下也能迅速完成移植，并成功避免了晚期AML再激发后的复发。然而，携带相同MOLM13 AML异种移植物和正常人旁观者细胞的人源化NSG小鼠未能对CD33-CAR T细胞产生反应，而ADCLEC.syn1在人源化小鼠中迅速消除了MOLM13的AML细胞。

在r/r AML PDX模型中，ADCLEC.syn1和CD33-CAR都导致CAR-T细胞的体内扩增，但只有ADCLEC.syn1诱导了完全扩增，CD33-CAR处理的小鼠用功能性LSC池复发，如系列AML移植所证明的。重要的是，CD33-CAR失效后的AML被ADCLEC.syn1成功消除。

总之，将AML和正常组织中的定量CAR靶向谱与临床前CAR疗效相结合，并将新的组合CAR设计ADCLEC.syn1与传统的CD33靶向CAR进行比较。研究结果揭示了CAR靶向“抗原库”在靶向正常旁观者细胞中高丰度抗原时限制临床疗效的潜在挑战。该研究正在MSKCC（NCT05748197）的首次人体1期临床试验中研究ADCLEC.syn1 T细胞治疗r/r AML。

郑州大学第一附属医院

  背景  ：CD19靶向的CAR-T细胞治疗已被证明是复发/难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤（r/r B-NHL）的一种可行的治疗选择。研究表明，39%至97%的临床B-NHL样本也表达B细胞成熟抗原（BCMA）。为了进一步提高安全性和疗效，研究人员一直在探索CD19和BCMA双靶向CAR-T，GC012F是通过一种新的下一代FasTCAR-T工艺制造，用于治疗r/r B-NHL。

  方法  ：从2021年10月到2023年1月，9名DLBCL患者在标准淋巴耗竭方案后3天（20 - 30 mg/m2 /day Flu, 250 - 300 mg/m2 /day Cy），在递增剂量组中加入并单次输注GC012F进行治疗。本研究的主要目标是安全性和耐受性；其次是药代动力学和疗效。细胞动力学释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）通过ASBMT 2019进行分级，并根据CTCAE 5.0评估不良反应。GC012F的有效性评估参考Lugano标准，分别通过流式和qPCR分析CAR-T细胞的扩增和CAR拷贝数。

▲CAR-T输注后数月随访数据

  结果  ：截至2023年1月16日的数据截止日期，中位随访207天（范围94-460），所有9名患者均接受了剂量水平为3.7×10 4至3×10 5 CAR-T/kg的单次GC012F输注，并完成了3个月或更长时间的随访。中位年龄为52岁（范围18-60）。8名患者入选Ann Arbor III/IV期疾病，1名患者接受了双重注射，4例患者预后指数（IPI）评分为3。所有患者淋巴瘤样本均表达CD19，7个样本中有6个表达BCMA，患者接受了包括利妥昔单抗和蒽环类药物在内的2线治疗，2例患者既往接受过自体造血干细胞移植。9例患者在第3个月的ORR为100%（9/9），第3个和第6个月的CR率分别为77.8%（7/9）和71.4%（5/7）。迄今为止，最长的缓解期为14.4个月，未观察到剂量限制性毒性。5名患者出现1级CRS，最大剂量组（3×105CAR-T/kg）的1名患者在2天内出现3级CRS，未观察到ICANS。在9名接受治疗的患者中，≥3级的TEAE为中性粒细胞减少症（7/9）、白细胞减少病（5/9）、血小板减少症（3/9）、淋巴细胞减少症（1/9）和贫血（1/9）。所有TEAE均在标准护理和支持护理的治疗后得到解决。外周血中CAR-T细胞的中位峰值拷贝数为71000拷贝/μg DNA（范围9263-185039），中位峰值时间为14天（范围9-21d）。患者的CAR-T几何平均AUC0-28为658538拷贝/μg DNA×天数（319104-1359031；95%可信区间）。在所有五名受试患者的肿瘤活检中也检测到CAR-T细胞。

   讨论  ：GC012F是一种CD19-BCMA双靶向CAR-T产品，用于治疗r/r B-NHL的首次人体试验显示出可管理的安全性和良好的临床疗效。第3个月时ORR为100%，77.8%（7/9）达到CR。GC012F CAR-T细胞可在肿瘤活检中检测到，表明CAR-T细胞可以渗入肿瘤病变。

德国法兰克福大学医院

  背景  ：CD33靶向嵌合抗原受体（CAR；CAR33）-T细胞已经显示出治疗急性髓系白血病（AML）的疗效。然而，CAR33-T细胞的临床应用仍然具有挑战性，这是由于其对自体细胞的杀伤限制和严重副作用的潜在风险。相反，自然杀伤（NK）细胞可以安全地给药于HLA不匹配的受体，并具有补充CAR介导的细胞毒性的内源性清除能力。最近报道了成功生成以CD33为靶点的初级CAR33-NK细胞的情况，这些细胞在体外以及AML异种小鼠模型中对AML具有高效的对抗作用（Albinger等人，《血液癌症杂志》2022）。然而，NK细胞功能可能会受到高水平的抑制性免疫检查点受体的影响，如NK细胞上表达的NKG2A（Bexte等人，Oncoimmunology 2022）。

▲相关研究文章

  目的  ：通过CRISPR/Cas9敲除（KO）CAR33-NK细胞中的杀伤细胞凝集素样受体C1（KLRC1）基因，有望在体外和体内改善CAR33-NK的功能。

  方法  ：通过慢病毒介导外周血源性（PB）NK细胞产生CAR33-NK细胞，再使用CRISPR-Cas9技术进行核转染，在CAR33-NK细胞中敲除编码KLRC1基因座的NKG2A。在无饲养细胞、基于IL-15/IL-2的扩增后，使用流式细胞仪和IncuCyte®分析CAR33和NKG2A的表达以及细胞毒性。用qPCR和表位转录组测序（CITE）-seq分析测定基因修饰的NK细胞的RNA和蛋白质表达的变化。在OCI-AML2（GFP+，Luc+）异种移植NSG-SGM3小鼠模型中评估其体内疗效。

▲策略示意图

  结果  ：慢病毒转到PB-NK细胞的CAR33阳性细胞高达60%，而KLRC1基因破坏导致NKG2A细胞表面表达减少50%。CITE-Seq和qPCR分析揭示了CAR33和CAR33-KLRC1-ko-NK细胞中不同的基因调控模式。在CAR33和CAR33-KLRC1-ko-NK细胞中CXCR4、CD16和CD70的上调表明NK细胞处于成熟和活化状态。与KLRC1-ko-NK或CAR33-NK细胞相比，CAR33-KLRC1-ko-NK细胞在体外细胞毒性测定中对CD33+/HLA-E+OCI-AML2细胞以及主要小鼠患者的清除率显著更高。此外，在NSG-SGM3 AML异种移植物小鼠模型中，与CAR33-NK细胞治疗相比，单次注射低剂量（3x10⁶个细胞）的CAR33-KLRC1 ko-NK细胞后，在体内观察到白血病负荷减少。两次注射3x10⁶的CAR33-KLRC1 ko-NK细胞均显示出优于KLRC1 ko-NK或CAR33-NK治疗的疗效，并导致AML和骨髓中的白血病起始细胞，经骨髓再植入分析证实。CAR33-KLRC1-ko-NK细胞在体内的应用显示出良好的安全性，并且与肺、肝和结肠的组织学分析一致，没有诱导任何副作用。

去除CAR-NK细胞中的抑制性受体NKG2A诱导增强了抗白血病NK细胞状态，这对AML的治疗显示出非常有益的效果。这种双重基因修饰有可能使NK细胞在与恶性细胞接触后绕过抑制，不仅在AML的治疗中，而且在广泛的其他恶性疾病中也可应用。

  背景  ：嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在复发或难治性（R/R）B细胞恶性肿瘤（包括多发性骨髓瘤）中取得了突出效果。然而，还没有一种被批准用于其他血液系统恶性肿瘤。CD84（SLAMF5）是一种在几种免疫细胞中表达的SLAM家族免疫受体，据报道它在慢性淋巴细胞白血病（CLL）中过表达。

  方法  ：（1）用流式细胞术研究CD84在免疫细胞，其中包括造血干/祖细胞（HSPC）和恶性细胞中的表达，以及通过免疫荧光研究其在人体组织中的表达。（2）第二代CD84 CAR-T是用不同的鼠或全人抗CD84单链抗体和4-1BB作为共刺激结构域设计的。（3）CD84 CAR-T的体外疗效通过细胞毒性、细胞因子产生和增殖测定来确定。通过对CD34+HSPC的细胞毒性试验研究了CART84的潜在骨髓毒性。使用AML和T-ALL细胞系或患者来源的异种移植物（PDX）在免疫功能受损的NSG小鼠中研究了CART84的体内疗效。

  结果  ：研究发现CD84在CLL、AML和T ALL的原发性患者恶性细胞表面高表达，而在CD34+HSPC上低表达。健康人体组织的免疫荧光分析显示，尽管在组织巨噬细胞中检测到CD84的表达，但CD84在肺、肝、肾、心肌、皮肤或大脑（大脑皮层和小脑）中不表达。这种表达模式与临床发展中几种CAR-T细胞的靶点CD123相似。

CART84在体外成功扩增，并对来自不同血液系统恶性肿瘤的细胞系产生高细胞毒性，包括侵袭性B细胞淋巴瘤（Ramos）、AML（MOLM-13）和T-ALL（MOLT4）（图A），CART84对CD34+HSPC的杀伤作用远低于对白血病细胞的杀伤作用。

尽管对HSPC的细胞有很低的毒性，但还是将重点放在AML和T-ALL上，因为这些患者可以通过异体造血干细胞移植（allo-HSCT）来挽救。在免疫缺陷NSG小鼠模型中，与对照组相比，CART84 的CD84.02和CD84.03控制了MOLM-13（AML）和MOLT-4（T-ALL）肿瘤的进展，并增加了小鼠的存活率（图B）。同样，在AML和T-ALL PDX模型中也获得了阳性结果。

▲靶向CD84的CAR-T体外（A）和体内（B）功效

由此证明CD84是一种很有前景的CAR-T靶点，用于治疗几种血液系统恶性肿瘤。CD84 CAR-T在体外和体内均显示出对AML和T-ALL细胞的高细胞毒性。这些数据支持CD84 CAR-T用于血液系统恶性肿瘤的治疗。对于其潜在的骨髓毒性，可以考虑异体造血干细胞移植疗法。

  背景  ：嵌合抗原受体（CAR）T细胞的过继转移彻底改变了B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）的治疗，但在最初的优异的治疗结果之后，出现了一些关键问题，如CD19阴性的出现，通过基于睡美人（SB）trasposon的平台（CARCIK-CD19）开发了一种抗CD19 CAR工程细胞因子诱导杀伤（CIK）细胞。在进行的CD19CAR-CIK的I/II期临床研究中，显示出优异的的结果。为了预防和解决CAR-T治疗后的白血病复发，因为利用SB技术实现多靶向治疗。在这里，提供了关于靶向B细胞特异性CD22与BAFF-R联合的数据，之前已经开发并证明了BAFF-R可以激活B-ALL。

  目的  ：旨在开发抗CD22和抗BAFFR-CAR，以多靶向策略用于抗CD19 CAR T细胞耐药性患者

  方法  ：利用电转技术，将编码抗CD22和抗BAFFR-CAR的SB质粒转染至健康供体PBMC开始产生CAR-CIK细胞。用流式分析CAR-CIK细胞的CAR表达、T细胞免疫表型和耗竭谱。用单靶向和双靶向CAR-T细胞评估体外杀伤活性。通过qPCR评估分化结束时的载体拷贝数（VCN）评估安全性，在急性白血病和淋巴瘤小鼠模型中评估体内疗效。

  结果  ：体外电转和活化后的抗CD22和抗BAFFR CAR-T细胞具有与CD19CAR-CIK相似的扩增动力学（图a）。CD22CAR-CIK的平均CAR表达（B组）为50.4±5.6%，BAFFR3CAR-CIK第三代为35.6±8.1%，BAFFR2CAR-CIK第三代则为22.3±10.3%。

关于CAR+细胞的免疫表型，观察到CD3+/CD56+细胞中富集，正如预期的那样，CD8+群体普遍存在（图C）。在分化结束时，记忆谱显示CD4和CD8 CAR+亚群中的中心记忆和效应记忆亚群富集（图D-E）。观察到抗CD22和抗BAFFR-CAR对NALM6细胞系的杀伤活性（图F）。为了评估CAR-CIK的质量和安全性，我们评估了VCN的转运，其产生的拷贝数低于5个/细胞，这被认为是临床级产品的安全释放途径（图G）。然后，使用DAUDI白血病小鼠模型在体内湿测试CD22CAR-CIK。值得注意的是，CD22CAR-CIK在第60天时根除了在外周血和器官中的疾病细胞，这与持续性有关，可通过外周血中的流式细胞术进行测量（图H）。

在本研究中证明了供体来源的SB转染的CD22CAR-CIK在体外和体内小鼠模型中具有显著的肿瘤活性的有效性、质量和安全性。进一步的实验正在进行中，以评估BAFFR-CAR T细胞的体内活性。总体而言，我们证明了CARCIK-CD22和CARCIK-BAFFR非病毒工程可用于预防和治疗CD19阴性B-ALL复发的多靶向方法。

美国安德森癌症中心

  背景  ：CAR-T细胞治疗显著改善了复发/难治性大B细胞淋巴瘤（rrLBCL）患者的预后，但许多患者没有长期获益，可能是由于CAR-T淋巴细胞衰竭，了解这些机制有可能确定改善合理治疗途径的结果。

▲图1 CD38/CD28/CD3抗体帮助免疫细胞靶向癌细胞

  方法  ：对13例rrLBCL肿瘤，包括7例CAR-T治疗早期肿瘤和6例CAR-T治疗难治性肿瘤进行scRNA-seq检测。分类并比较各组之间主要细胞类型和亚群的频率、克隆优势和表达谱。在细胞毒性试验中评估了SAR442257的作用，并将其与缺乏CD38或CD38/CD3/CD28靶向区的对照抗体进行了比较。RL和HT淋巴瘤细胞系经CRISPR敲除CD19和用作靶细胞的等基因WT克隆，单采rrLBCL患者PBMC构建制备CD19 CAR-T细胞在1:1的效靶比下共培养24小时或48小时。

  结果  ：scRNA-seq显示，与CAR-T治疗早期肿瘤相比，CAR-T对难治性rrLBCL肿瘤具有显著表达更高的耗竭相关LAG3+TIM3+CD38+CD8 T细胞（CD8耗竭，Tex）部分，具有高表达的T细胞功能障碍和Tex特征。CD8Tex在CAR-T难治性肿瘤中最常见，并在所有CAR-T难治性肿瘤内检测到的CAR+CD8 T细胞中富集。之前已经在rrLBCL患者的axi-cel输注产物中发现了富集的类似细胞，但这些细胞没有反应。TCR克隆型分析显示，与CAR-T早期肿瘤相比，CD8Tex簇内的T细胞克隆高度扩增，克隆优势显著增加，CAR-T难治性中CD8Tex细胞的克隆多样性降低。

单细胞差异基因表达显示，与CAR-T早期肿瘤相比，CAR-T难治性的CD8 T细胞中LAG3、TIM3和CD38的表达显著增加。

细胞毒性测定显示，SAR442257显著增加了CAR-T细胞对HT和RL WT（CD19+/CD38+）细胞的杀伤作用（24小时HT P值=3e-4，24小时RL P值=1e-2），这种杀伤作用持续48小时。将SAR442257添加到CAR-T细胞中可以杀死HT和RL CD19KO（CD19-/CD38+）（24小时HT P值=8e-7，24小时RL P值=2e-8），其水平类似于WT细胞中的组合。添加缺乏CD38或CD38/CD3/CD28靶向区的抗体不会增强CAR-T细胞毒性或CD19KO靶点的再杀伤。

  讨论  ：CAR-T难治性rrLBCL的肿瘤微环境富含表达CD38的克隆扩增和CD8 T细胞的最终耗尽，CD38/CD28/CD3三特异性抗体SAR442257通过识别肿瘤上的CD38、共刺激CAR-T细胞和诱导CD38+T细胞自相残杀来提高CAR-T细胞的活性，导致显著的肿瘤细胞杀伤。此外，SAR442257允许CD19 CAR-T细胞杀死CD19/CD38+LBCL细胞。

郑州大学第一附属医院

  背景  ：自然杀伤/T细胞淋巴瘤（NKTCL）是一种预后不良的侵袭性淋巴瘤，在过去的十年里，嵌合抗原受体转导的T（CAR-T）细胞治疗是一种很有前途的治疗血液系统恶性肿瘤的策略。研究人员评估了CAR-T细胞靶向CD38在多发性骨髓瘤和NKTCL中的有效性，而LMP1可能诱导B细胞和上皮细胞的恶化，使其成为NKTCL中不可忽略的分子，这些揭示了CD38和LMP1靶向治疗的临床潜在性。

  方法  ：构建四个第二代CAR-T细胞，包括两个单靶向CAR（CD38-CAR和LMP1-CAR）和两个串联CAR（CD38-LMP1-Tan-CAR1和Tan-CAR2），然后在体外和体内评价四个CAR T对NKTCL细胞的影响。

   结果  ：4个CAR-T细胞在体外能有效地清除恶性靶向阳性NKTCL细胞，并能以靶向依赖的方式活化和产生炎性细胞因子，在CD38+LMP1+NKTCL细胞的刺激下，2个Tan CAR-T淋巴细胞产生的IL-13、颗粒酶B、IFN-γ和TNF-α均高于LMP1-CAR T细胞。体内实验表明，在异种移植NKTCL小鼠模型中，CAR T细胞也表现出显著的抗肿瘤作用。在体外和体内，两个Tan-CAR T细胞对CD38+LMP1+NKTCL细胞的杀伤活性均高于单靶向CAR-T细胞。