环状RNA的特征与应用前景（二）
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简述circRNA的体外合成策略
上期回顾：上期我们简要介绍了circRNA的部分特征：与mRNA相比，circRNA在细胞质中具有更高的稳定性，并且未修饰转录本的免疫原性也较低。circRNA的这两个关键优势，可以充分发挥RNA疗法的全部潜力。
上期环装RNA系列文章链接：环状RNA的特征与应用前景（一）
在过去的十数年中， RNA 技术在生物医药领域获得了显著发展，特别是全球新冠疫情大流行期间，mRNA疫苗技术更是一鸣惊人。这一新兴的治疗方法副作用少、成本低、疗效好、可及性高，在传染病、肿瘤，罕见病的等多个领域显示出巨大的潜力。然而，RNA的不稳定性、免疫原性等性质一直阻碍其在临床中的应用。幸运的是，circRNA的多种先天优势则有可能克服mRNA的这些弱点，让RNA更好的发挥其在生物医药领域中的潜力。
近年来，研究人员开发出几种体外合成circRNAs的方法（见图一）。这一期我们将分享几种常见的体外合成circRNA的策略。
图一｜circRNAs的发现、研究与开发的重要事件时间表。 circRNAs的概念于1976年提出，2012年人们开始对其进行广泛的研究，并确认了circRNAs的丰度、功能和稳定性。（doi.org/10.3389/fbioe.2021.787881）
目前体外合成circRNA的主要方法是将线性RNA前体末端连接，形成共价闭合环（见图二）。线性RNA可以通过化学方法或酶促工艺合成生产。化学合成方法可以在合成过程中可以直接引入5′单磷酸，便于后续环化。然而，化学合成纯化成本高、产量低，且多用于生产小分子RNA（<于50 ~ 70nt）。因此，酶促法是目前主要的线性RNA合成方法。
图二｜线性RNA前体是由体外转录产生的，线性RNA前体连接合成circRNA。（doi: 10.3389/fbioe.2021.787881 ）
酶促法通常是通过体外转录反应（in vitro transcription ，IVT)来实现的，反应体系主要包括DNA模板、反应缓冲液和噬菌体RNA聚合酶。噬菌体RNA聚合酶通常来源于T7、SP6或T3噬菌体，其中T7 RNA聚合酶最为常见。IVT反应可以以较低的成本合成较长RNA。然而，噬菌体聚合酶run-off性质可能导致合成不完整的RNA序列，一些研究通过突变野生型噬菌体RNA聚合酶提高了转录质量，减少了副反应。研究人员已经开发了几种将体外线性RNA前体连接成环的方法，包括化学连接法、酶连接法和核酶连接法。化学连接是通过使用BrCN或1-乙基-3-(3 ' -二甲氨基丙基)碳二酰亚胺连接DNA-RNA杂合体来实现的，但是这种方法不仅效率低，而且存在生物安全问题。此外，化学连接形成2 '，5 ' -磷酸二酯键，而不是天然的3 '，5 ' -磷酸二酯键。因此，研究人员对circRNA的酶促合成法更感兴趣。酶促连接主要分为 T4连接酶连接、核酶连接，以及发卡核酶连接。
酶促连接
1、来自T4噬菌体的酶
酶促连接是通过来自噬菌体T4的T4 DNA ligase （T4 Dnl）、T4 RNA ligase 1 （T4 Rnl 1）以及T4 RNA ligase 2（T4 Rnl 2）催化连接而成（见图三）。
值得注意的是，这类连接反应需要线性RNA前体提供受体底物上的3 ' -OH和供体底物上的5 '单磷酸。如果线性RNA前体是通过化学合成产生的，可以在合成过程中掺入一个5 '单磷酸，或者在合成后使用ATP和T4多核苷酸激酶加入。然而，IVT反应合成线性RNA前体通常从5 ' -pppG开始，因此必须先将5 ' -末端去焦磷酸化，之后再用ATP和T4多核苷酸激酶加入5 '单磷酸。
T4 Dnl可以连接双螺旋的双链结构，如DNA/RNA杂交链。(见图三)。该连接方法需要借助一个cDNA模板或桥来实现。一般来说，高质量的连接需要cDNA桥在连接结点的两侧至少有10个核苷酸。该方法的优点是提高了连接位点的精准性。其劣势在于线性RNA前体的末端不能有明显的RNA二级结构，并且在双螺旋区域不能出现高含量的“U”。此外，T4 Dnl在DNA/ RNA杂交链中的连接效率低于dsDNA。因此，只有少数研究使用这种方法进行RNA连接。
T4 Rnl 1是一种常见的RNA连接酶。T4 Rnl 1催化3 ' -OH末端与活化的5 ' -末端的亲核攻击，形成5 '，3 '-磷酸二酯键，并生成circRNAs。一些研究使用cDNA桥来防止线性RNA前体折叠成不合适的结构。有趣的是，T4 Rnl 1对末端的核苷酸有明显的偏好， 3′端为A > G ≥ C > U；5′端为pC > pU > pA > pG。T4 Rnl 1可以合成短至6-8nt的circRNAs，还可以高效连接ssRNA。但是若是大分子RNA，或线性RNA前体末端存在显著二级结构，T4 Rnl1连接效率会大大降低。此外，T4 Rnl1还可能发生分子间末端连接(oligomerization)，是一种严重的副反应，这种副反应会随着线性RNA前体浓度的增加而增加，从而限制了RNA环化的数量。
T4 Rnl 2也可用于RNA连接。与T4 Rnl 1类似， T4 Rnl 2也催化3 ' -OH末端与5 ' -末端形成共价的5 '，3 ' -磷酸二酯键。不过，T4 Rnl 2在连接dsRNA时显示更高的酶活性。因此当线性RNA前体存在二级结构时，T4 Rnl 2的连接效率远高于T4 Rnl 1。此外，在RNA夹板的帮助下，T4 Rnl 2还可以完成ssRNA末端的连接。然而，RNA夹板的方法不能用于短RNA前体的连接，当线性RNA前体长度小于30nt，夹板-前体复合物在空间上是不稳定的。同样，T4 Rnl 2对大片段RNA连接效率低和且存在副反应的问题。
图三｜酶促反应的连接策略（Doi.org/10.3390/ ijms232113247 ）。(A) T4 Dnl可以连接双螺旋的双链结构，如DNA/RNA杂交链。借助cDNA bridge，T4 Dnl可以实现精确的RNA连接。(B) T4 Rnl 1催化3 ' -OH末端对活化的5 ' -末端的亲核攻击，形成共价的5 '，3 ' -磷酸二酯键。cDNA桥可以防止线性RNA前体折叠成不合适的结构。(C) T4 Rnl 2更适用于连接处为双链的线性RNA前体。在RNA夹板的帮助下，T4 Rnl 2也可以实现ssRNA末端的连接。
T4 Dnl和T4 Rnl 1和T4 Rnl 2的比较见下表。这三种连接酶虽然各有优势，但对于大片段RNA的连接效率很低。表一：来自T4噬菌体连接酶在circRNA体外合成中的比较
核酶又称为核糖核酸内切酶(ribozyme)，是一种特殊的内含子，可以在没有任何酶或蛋白质因子存在的情况下，通过自我剪接反应将自身从前体中剪切去除，并将相邻的5'-端和3'-端外显子(exon) 连接成成熟mRNA。其中I型内含子主要存在于线粒体、叶绿体及某些低等真核生物的rRNA基因中，极个别的存在于原核生物的噬菌体中；II型内含子主要见于细胞器(如线粒体)、细菌中。
1992年，Puttaraju和Been首次使用“Permuted Introns and Exons (PIE)”方法利用I型内含子自我剪接的催化活性将RNA环化。PIE是当前最为常见的体外合成circRNA的技术。PIE就是将I/ II型内含子和外显子剪切置换位置后，重新排列的内含子-外显子构建体。目的基因（GOI）可以整合到外显子中，转录后剪接合成circRNA（见图四）。以“PIE序列”为模版转录的RNA通过两次酯交换反应后成环。第一次酯交换反应释放PIE结构的5'端内含子。在第二次酯交换反应中，新生成的3'端外显子的游离3'-OH基团攻击3'端的剪接位点，释放circRNA和3'端内含子。
II型内含子也可用于circRNA的合成，这涉及到一个反向剪接反应，即外显子末端的5 '剪接位点与同一外显子开头的3 '剪接位点的连接。与I型内含子相比， II型内含子催化的反向剪接无需外显子序列。因此，该方法可以更精确地连接线性RNA前体。然而，这种方法在连接处形成2 '，5 ' -磷酸二酯键，而非天然的3 '，5 ' -磷酸二酯键，其机制尚不清楚。
图四｜基于I/II型内含子的PIE方法原理。I型内含子或II型内含子核酶的机制略有不同，但两者都可以应用于PIE法。“PIE序列“包含端到端融合外显子，I型内含子的5 'Half（灰色）位于外显子的尾部，3 'Half（黑色）位于外显子的头部，目的基因（GOI）可以整合到外显子中，从而允许环状rna的合成。
与T4 DNA/RNA连接酶法相比，基于I型内含子PIE法更适合大片段circRNA的合成，且反应条件和纯化方法简单。基于这些优点，PIE法是目前研究最多、应用最广泛的circRNA连接方法。例如Orna Therapeutics，一家知名的致力于开发应用工程化circRNAs治疗癌症、自身免疫性疾病和遗传性疾病的公司，合成circRNA主要采用了I型内含子自剪接系统。然而，但PIE法也有其不足之处。由于RNA二级结构的复杂性，不同的RNA序列会导致最终circRNA域存在很大差异，这限制了PIE方法的应用。另外，由于外源外显子序列的引入，造成了最终的circRNA序列与原始的线性RNA前体序列的差异，这有可能会影响circRNA某些功能的验证。基于I型内含子PIE法引入的剪接疤痕(E1和E2片段)还会导致免疫原性，而II型内含子PIE法可以避免这一问题。
为进一步优化PIE方法，研究人员尝试了不同的改造策略来提高环化效率。例如研究人员在线性RNA前体的5’端和3’端添加同源臂（homology arms）以稳定内含子并促进折叠，不仅仅显著的提高了环化效率，还将环化的长度延长到了5kb，并且优化后的circRNA能够产生大量的可纯化蛋白。国内的科锐迈德的Clean-PIE系统则可以通过筛选编码区或IRES区中最优成环位点，无需引入外源外显子序列E1和E2，同时还可以提高环化效率。相反，环码生物则选择Ⅱ 型内含子PIE技术。该技术在保证环化效率的同时，避免了环化过程中可能引入的免疫原性增加的问题。并且，由于反应条件比较温和，适合于工业化放大。
3、发夹核酶(Hairpin ribozyme, HPR)
HPR可以通过滚环反应和环状单链DNA模板的自剪接反应产生circRNA（见图五）。具有HPR的线性RNA前体将折叠成两种可选择的裂解活性构象，以去除3 '端和5 '端。因此，中间体将含有一个5 ' -OH和一个2 '，3 ' -环磷酸（cyclic phosphate）以产生目标circRNA。
该方法主要用于小circRNA生产，冷冻、离子条件和其他辅助因子都可能影响HPR的活性。这种方法明显的缺点主要有两方面：1，由于HPR催化的分割和连接的动态平衡，circRNA不稳定；2，circRNA含有HPR序列，这可能会对一些circRNA的功能产生负面影响。
图五｜发卡核酶合成circRNA的策略
小结与下期预告
尽管体外合成circRNA的方法很多，但仍然存在许多挑战和机遇（见表二）。下期，我们讲简述circRNA的治疗应用前景，敬请关注。
表二｜circRNA不同合成策略的比较
Ref：
1.doi: 10.3389/fbioe.2021.787881
2.doi.org/10.3390/ ijms232113247
3.doi.org/10.1093/nar/gkad554
4.doi: 10.1080/15476286.2016.1239009
5.doi.org/10.1101/2022.06.20.496777
6.doi: 10.1038/s41467-018-05096-6
7.doi.org/10.1038/s41388-023-02780-w
8.doi.org/10.1038/s41587-022-01491-z
9.doi:10.13523/j.cb.21042
10.https://mp.weixin.qq.com/s/E7I3UcfrGjp_akGCSE1trQ
11.https://mp.weixin.qq.com/s/M952-3CENHOVrvzEvbLm6g
来源：宜明生物
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E.N.D
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