Nature重磅综述：基于mRNA的癌症疗法
与传统方法相比，mRNA技术可以在更短的时间内生产出不同的疫苗和治疗方法，而且费用更低，因此近年来基于mRNA的治疗方法的研究激增。近日哈佛医学院纳米医学中心陶伟教授团队在Nature发表了一篇题为“mRNA-based cancer therapeutics”的综述文章，系统地介绍了基于IVT-mRNA治疗癌症的方法（编码肿瘤抗原、细胞因子、肿瘤抑制剂、T细胞工程化受体和CRISPR-Cas9基因编辑）、各类体外合成mRNA的特点【常规mRNA、自扩增mRNA（saRNA）、反式扩增mRNA（taRNA）和环状mRNA（circRNA）】、高效mRNA递送系统、临床前和临床研究、当前面临的挑战和未来的展望，预计将出现更多有前景的基于mRNA的治疗方法转化为临床应用，最终造福患者。早在新冠（SARS-CoV-2）大流行之前，针对HIV-1（NCT02413645）、流感（NCT03076385）、寨卡病毒（NCT03014089）和其他传染病的mRNA疫苗进行了I期和II期试验。而随着新冠mRNA疫苗的成功应用，引发了人们对mRNA疗法潜力的兴趣。
体外转录的常规mRNA与天然mRNA一样，由5′Cap、5′和3′UTR、开放阅读框（ORF）和poly(A)尾组成（图1）。IVT-mRNA易于调节，合成简单，可以大量生产用于治疗各种疾病。然而基于mRNA的治疗，需要降低免疫原性并提高翻译效率。例如，自体或合成的5′帽类似物、5′和3′UTR的序列优化、ORF的密码子优化、增加GC含量和假尿苷替换可以增强mRNA的稳定性和翻译功效，并降低其免疫原性。还可将3′poly（A）尾部的长度保持在120–150个核苷酸以内，并添加化学修饰的腺苷可以有效地提高mRNA的稳定性和蛋白质表达。高效液相色谱（HPLC）纯化也可用于去除核苷修饰的体外转录mRNA的双链RNA污染物，可以将翻译效率提高1000倍，并防止炎性胞质分裂。
▲图1 用于癌症治疗的体外转录mRNA
除此之外开发了传统mRNA的替代候选者，如saRNA、taRNA和circRNA ；它们具有更稳定的结构、更高的蛋白质产量和在疾病治疗中的独特作用。例如，与传统mRNA的结构相比，saRNA在ORF区包含四个非结构基因（nsP1、nsP2、nsP3和nsP4），它们用于产生RNA依赖性RNA聚合酶（RDRP）从而引发自复制，因此saRNA的蛋白表达持续时间比传统mRNA更长。然而saRNA具有调节免疫系统的固有佐剂作用，难以控制，并且这种自扩增可能干扰宿主细胞中的正常信号转导。与saRNA相比，taRNA更安全。taRNA含有两个独立的RNA，可以降低如saRNA的风险，而且taRNA长度较短更容易大批量制备。circRNA的独特结构，可防止其不被核酸外切酶识别，为其提供了更高的稳定性、更长的蛋白质表达持续时间和对mRNA酶的抗性。然而，circRNA的修饰和合成比其他形式更困难。
已经开发和研究了稳定且安全的非病毒mRNA递送材料和纳米平台，包括脂质和脂质衍生物、阳离子脂质、可电离脂质和其他种类的脂质，以这些脂质形成的纳米颗粒将保护mRNA免受细胞液中核糖核酸酶降解。目前，新冠疫苗mRNA-1273和BNT162b使用脂质纳米颗粒，已在临床上证明了高效的mRNA递送和总体疗效。它们都由可电离的脂质（分别在mRNA-1273和BNT162b中为SM-102和ALC-0315）、PEG化脂质、胆固醇和辅助脂质组成。这种递送载体既提高了mRNA递送的效率，又能够通过调节脂质纳米颗粒中各种成分的比例来靶向特定器官或细胞。递送载体也具有佐剂作用，正如最近的一项研究证明，脂质纳米颗粒在小鼠中诱导强烈的T细胞和体液反应，其佐剂效力比AddaVax（一种常用的疫苗佐剂）更强。由特定阳离子脂质组成的脂质纳米粒还通过激活Toll-like receptor 4（TLR4）信号增强mRNA癌症疫苗的抗肿瘤功效。此外，筛选mRNA递送载体的配方还可使脂质纳米颗粒可以在T细胞上与电穿孔方法相当水平的表达CAR，使脂质纳米颗粒也成为CAR-T细胞的一个有前景的平台。
mRNA肿瘤疫苗可以根据癌细胞表达的肿瘤抗原特异性设计，并引发强烈的体内抗肿瘤T细胞或B细胞反应。通常，肿瘤抗原由两个主要组成，肿瘤相关自身抗原（TAAs）和肿瘤特异性抗原（TSA）。TAA通常在肿瘤细胞中过表达，但也存在于正常组织中，具有较弱的肿瘤特异性和免疫原性。而TSA是来源于肿瘤细胞突变的抗原，具有高的肿瘤特异性和免疫原性，但机体耐受性较弱。截至目前许多临床前和临床研究都证明了mRNA疫苗在治疗癌症中的可行性（表1）。
▲表1 2018年至2022年期间基于编码肿瘤特异性抗原的mRNA癌症疫苗的临床试验
TAA疫苗最常用于肿瘤治疗（图2a），然而哺乳动物对单一TAA具有高度免疫耐受性。因此，需使用多种TAA组合来提高癌症疫苗的效率。值得注意的是，这些编码多种TAA混合物的疫苗已广泛用于各种类型肿瘤的临床前和临床研究。
DC在诱导特异性肿瘤抗原反应中至关重要，是mRNA癌症疫苗的理想的递送目标。DC主要来源于患者，并且在转染相应的mRNA后可以形成一种mRNA疫苗。这方面的第一个例子是在1966年报道的，当时用编码mRNA的卵清蛋白（OVA）电穿孔树突细胞。自那时以来，已开发出多种用于癌症治疗的树突状细胞疫苗，如用于临床治疗急性髓细胞白血病（AML）和慢性髓细胞白血病的早期树突状细胞mRNA疫苗仅编码WT1蛋白（NCT00965224和NCT01291420）。后来，含有可编码多种TAA组合的单个体外转录mRNA的树突状细胞疫苗被用于癌症治疗。肿瘤总RNA是指来自肿瘤组织和肿瘤细胞的总RNA分子，也可用于癌症疫苗的设计，避免筛选TAA，并诱导T细胞对肿瘤内的多种抗原产生免疫反应，该方法在葡萄膜黑色素瘤、胰腺癌症、神经母细胞瘤和弥漫性桥脑内胶质瘤（NCT01983748、NCT04157127、NCT004837547）的临床试验中是安全可行的。
脂质保护mRNA癌症疫苗是由DOTMA、DOTAP和DOPE形成的脂质复合物，通过调整mRNA与阳离子脂质的比例，可实现不同器官的靶向，带负电荷的mRNA脂质体主要进入脾脏中的树突细胞以诱导T细胞反应，而带正电荷mRNA脂体主要靶向肺。在一项正在进行的I期临床试验（NCT02410733）中，119名黑色素瘤患者已单独或与PD-1抑制剂联用编码黑色素瘤特异性TAA（即NY-ESO-1、MAGE-A3、TPTET和酪氨酸酶）的Lipo-MERIT疫苗进行了治疗。尽管患者表现出轻微的流感样不良事件，但每月持续接种疫苗的患者对肿瘤抗原表现出持久而强烈的CD4+和CD8+T细胞反应，并在一年以上保持稳定。
基于这些试验的成功，BNT111疫苗被FDA授予治疗黑色素瘤的快速通道指定。一项临床试验正在评估BNT111疫苗与PD-1抗体联合治疗不可切除的III期和IV期黑色素瘤患者的耐受性、安全性和疗效（NCT04526899）。此外，在几个正在进行的一期和二期临床试验中，使用Lipo-MERIT疫苗平台对各种TAA进行编码，用于治疗头颈部鳞癌（NCT04534205）、卵巢癌症（NCT04163094）、前列腺癌症（NCT44382898）和胶质母细胞瘤（NCT004526899）。然而，TAA疫苗的固有特性在一定程度上限制了其应用。例如，肿瘤中的TAA可能发生突变并产生疫苗耐药性；由于TAA也存在于正常组织中，靶向TAA的肿瘤疫苗可能会引起中枢和外周耐受，导致疫苗效力降低。
▲图2 编码肿瘤相关抗原或新抗原的mRNA癌症疫苗的开发
与TAA不同，TSA是由于肿瘤细胞中的突变而产生的，因此不会影响中枢免疫耐受。因此，TSA疫苗或新抗原疫苗是治疗癌症的一种有吸引力的疫苗形式（图2b）。一般来说，癌症细胞中的新抗原被蛋白酶降解为小肽，这些小肽在内质网上加工并呈现给细胞表面的分子。这些新表位-主要组织相容性复合体（MHC）复合体被CD4+和CD8+T细胞识别，以诱导细胞免疫反应。或者，释放到细胞外液中的TSA可以被肿瘤微环境中渗透的抗原呈递细胞吸收并呈递。癌症患者肿瘤细胞内的独特突变特征还 可用于个性化疫苗设计。例如一种编码KRAS驱动突变（G12C、G12D、G12V和G13C）的个性化mRNA疫苗（mRNA-5671），通过脂质纳米粒与pembrolizumab（一种靶向PD1的单克隆抗体）联合治疗胰腺癌症。I/II期临床试验的结果显示，在九个周期的肌肉注射疫苗（每3周）后，患者有强烈的抗肿瘤免疫反应，疫苗耐受性可接受（NCT03480152）。此外，FDA加快了一种基于mRNA的个性化癌症疫苗的审批，该疫苗由编码多达34种新抗原（mRNA-4157/V940）的单个合成mRNA组成，并与pembrolizumab联合使用，用于高危黑色素瘤患者完全切除后的辅助治疗。其IIb期试验（NCT03897881）显示，与单独的pembrolizumab相比，复发或死亡风险降低了44%，转移率降低65%。这些结果证明临床试验中mRNA癌症治疗的有效性。即便如此，新的抗原疫苗的广泛使用也面临着一些限制，这是因为患者特异性治疗的成本极大地限制了个性化疫苗的开发和应用。
细胞因子可以具有自分泌和旁分泌作用，被认为是TME的有效调节剂。mRNA产生的细胞因子比表面工程重组细胞因子具有潜在的优势，因为它们理论上可以保持其信号活性。mRNA技术可以快速且经济高效地生产大量基于细胞因子的治疗分子，使其成为与重组细胞因子相比广泛使用的一种有吸引力的选择。此外，将编码细胞因子的mRNA封装在纳米颗粒中可以延长细胞因子的半衰期，无论是系统注射还是肿瘤内给药后在局部环境中的半衰期（图3a）。
IL-2通常以中等亲和力与IL-2Rβ（CD122）和IL-2γc（CD132）结合，解离常数（KD）约为1 nM，以促进T细胞的扩增个和分化。然而，调节性T细胞（Treg细胞）对IL-2结合更敏感，因为它们以更高的亲和力组成性表达IL-2Rα（CD25）（KD～10 pM）检测IL-2。当受到刺激时，IL-2诱导Treg细胞中FOXP3的表达，从而使抗原特异性CD8+T细胞与Treg细胞的比例增加，控制肿瘤进展。另一项研究表明，设计IL-2变体mRNA-LNP可以降低IL-2对Treg细胞的结合亲和力。在荷瘤小鼠中通过静脉给药的IL-2变体mRNA-LNP可以增加抗原特异性CD8+T细胞的扩增，而不会显著升高Treg细胞。IL-2变体mRNA-LNP与PD1和PDL1检查点抑制的组合在荷瘤小鼠中产生了显著增强的抗肿瘤作用。
1986年，重组干扰素α被批准用于治疗白血病，后来被证明对其他一些癌症有效，包括基底细胞癌和鳞状细胞癌。然而，IFNα在癌症治疗中的广泛临床应用受到高成本的阻碍。而使用电转mRNA方法在体外实验中证明IFNα-mRNA有效转染到人皮肤中。与天然序列IFNα-mRNA相比，使用GC序列优化和珠蛋白UTR替换的IFN-mRNA变体导致更高的IFNα蛋白表达。
IL-12是一种多效性促炎细胞因子，由两个基因IL-12B（编码p40）和IL-12A（编码p35）编码，通过刺激T细胞和自然杀伤细胞，导致持久的多效免疫反应。在肝细胞癌的小鼠模型中，发现静脉注射的IL-12mRNA-LNP分布在肿瘤内和正常肝组织周围，激活了肿瘤内的CD44+CD3+CD4+辅助性T细胞，并通过增加IFNγ使得肿瘤消退。
▲图3 mRNA编码的细胞因子和肿瘤抑制因子用于癌症治疗
与编码单一细胞因子的mRNA-LNP相比，用编码两种或多种协同细胞因子的mRNA混合物治疗可以诱导对肿瘤的广泛免疫。例如，肿瘤内递送编码IL-12和IL-27的mRNA-LNP可以诱导免疫效应细胞（包括自然杀伤细胞和CD8+T细胞）向黑色素瘤小鼠模型中的强大浸润。包封编码IL-23、IL-36和OX40L的mRNA混合物LNP肿瘤内递送可以在TME中产生强大的抗肿瘤反应；它导致下游细胞因子和趋化因子的表达，以及树突细胞、先天淋巴细胞和适应性淋巴细胞的活化。这种mRNA混合物目前正在进行I期临床评估（NCT03739931）。尽管与静脉给药相比，肿瘤内递送mRNA-LNP可以降低全身毒性，但在肿瘤内递送后的正常器官中发现了mRNA的脱靶翻译。瘤内直接注射N1-甲基假尿苷（m1ψ）替换GM-CSF、IL15-sushi（IL-15受体α链的sushi结构域与IL-15细胞因子融合）、IFNα和scIL-12的修饰mRNA混合物有效诱导了抗原特异性T细胞的系统表达和免疫记忆的形成。尽管在肿瘤内递送后的正常器官中没有观察到这种修饰的mRNA混合物的脱靶翻译，但与基于脂质的载体相比，它的mRNA翻译效率较低。mRNA混合物与PD1抗体的联合进一步增强了荷皮下小鼠黑色素瘤或癌症小鼠的抗肿瘤反应。此外，将编码四种人类细胞因子（GM-CSF、IFNα、IL-15–sushi和scIL-12）的mRNA混合物瘤内注射到携带人类黑色素瘤肿瘤的异种移植物小鼠中，导致每种瘤内四种细胞因子的表达。此外，用这种四细胞因子mRNA混合物对从晚期癌症患者分离的外周血单个核细胞（PBMC）进行体外刺激，可以诱导显著的IFNγ产生。目前正在对这种编码细胞因子的mRNA混合物进行临床研究（NCT03871348）。
CRISPR–Cas9由Cas9核酸内切酶和引导RNA（sgRNA）组成，是一种广泛使用的基因编辑工具，可以为治疗癌症提供一种新的方法。CRISPR -Cas9与传统癌症治疗相比，治疗可以永久破坏癌症细胞生存基因，避免多次重复给药治疗，提高治疗效果。将Cas9和sgRNA这两种成分成功地输送到靶细胞中是治疗成功的关键。通常，Cas9可以使用蛋白质、DNA或mRNA递送，直接递送Cas9蛋白是最简单的方法；然而，它也会引发不利的体液和细胞免疫反应，并在直接进入细胞会被快速降解，导致基因编辑的维持时间缩短。此外，Cas9蛋白相当大（160 kDa），这使得病毒和非病毒递送系统都具有挑战性。对于以DNA形式递送Cas9，质粒和腺相关病毒是最常用的载体，因为它们可以产生持续的蛋白表达。然而，Cas9的连续表达不可避免地产生高脱靶效应，增加了非癌细胞遗传物质脱靶突变的风险。
▲图4 编码Cas9的mRNA介导癌症免疫治疗
体外转录mRNA的策略不仅大大减少了潜在的脱靶效应，还最大限度地减少了细胞核中的基因毒性，实现了有效的基因编辑（图4）。不幸的是，大多数负载Cas9 mRNA的载体主要在肝细胞中表现出效力，而在非肝组织中递送是一个主要未实现的目标。已有多项研究对编码Cas9的mRNA–LNP在癌症治疗的器官靶向和基因编辑中的应用进行了评估。如LNP成分的调节，用选择性器官靶向（SORT）分子补充LNP配方或使用新型可电离磷脂（iPho），允许Cas9 mRNA和sgRNA精确递送到小鼠的肝、脾和肺，在正常小鼠中完成组织特异性基因编辑。另一项研究表明，Cas9 mRNA和sgRNA在抗体负载的靶向LNP导致侵袭性原位胶质母细胞瘤约70%的基因编辑和卵巢肿瘤约80%的基因编辑。肿瘤组织中Cas9 mRNA递送和基因编辑效率的增强也可以通过使TME更具渗透性来实现。包封Cas9 mRNA、sgRNA和FAK小干扰RNA（siRNA）的多功能LNP能够克服肿瘤细胞膜力学和细胞外基质硬度。由于FAK敲低，LNP的细胞内吞作用和肿瘤穿透增加，大大提高了CRISPR–Cas9基因编辑效率，从而抑制了四种癌症小鼠模型中的肿瘤生长和转移。
过继T细胞疗法在许多临床前和临床试验中显示出治疗癌症的希望，TCRs和CARs的体外修饰方案对治疗的成功与否至关重要。到目前为止，已有多款CAR-T产品获批，还有一些 CAR-T或TCR-T细胞疗法正在临床研究中。
通过逆转录病毒或慢病毒将TCR或CAR引入自体或同种异体T细胞，然后体外扩增。然而，这种类型的病毒转导使受体细胞面临基因突变的风险。鉴于此，mRNA编码CAR或TCR用于工程化T细胞的策略优于病毒，因为其高转染率和无基因突变的风险（图第5a段）。在很多研究中，mRNA-CAR的电穿孔已经被用作病毒转染的新替代方案。已发表的实验结果表明，这种方法能够在T细胞表面瞬时表达CARs约1周，同时避免可能的针对CARs的免疫反应。CARs在T细胞表面的表达持续时间与细胞内编码CARs的mRNA活性持续时间相关。当所有转染的CAR mRNA都失活时，CAR将不再存在于T细胞表面。由于编码CAR或TCR的mRNA在有限的时间内（约1周）表达，这需要患者在每个治疗周期内重复注射mRNA CAR-T，以保持CAR在体内的连续表达。修改mRNA的结构以提高稳定性和翻译效率可以有效延长CARs或TCRs的表达，减少重复剂量的需要。早期临床前研究表明，mRNA转染的编码CAR或TCR的T细胞可以有效对抗表达相应抗原的癌细胞，在早期I期试验（NCT01355965）中评估了编码间皮素1的mRNA转染的CAR-T细胞的治疗效果。在另一项转移性胰腺导管腺癌（NCT01897415）的临床试验中，6名患者接受了用编码嵌合抗间皮素免疫受体SS1的mRNA转导的静脉注射T细胞。在治疗过程中，没有一名患者出现任何显著的不良反应，两名患者病情稳定，生存率显著提高。
▲图5 mRNA编码CAR和TCR工程化T细胞的体外和体内递送
尽管基于mRNA的体外工程化CAR-T或TCR-T细胞具有在T细胞表面产生高水平编码的CAR或TCR的优点，但得到的工程化T细胞是个体化的细胞治疗产品，需要从患者身上提取T细胞，并且需要昂贵且耗时的制备程序。为了克服这些挑战，可以通过静脉注射给药靶向编码CAR或TCR的mRNA纳米颗粒的T细胞，从而在体内产生CAR或TCR工程化的T细胞（图第5b段）。之前有一份项研究探讨了将T细胞靶向的mRNA纳米载体注射到小鼠体内，以瞬时表达CAR或TCR-T，从而在小鼠模型中治疗淋巴瘤、前列腺癌和HBV诱导的肝细胞癌。
对于上面陈述仔细考虑和研究将有助于进一步发展用于癌症治疗的mRNA技术。预计SARS-CoV-2 mRNA疫苗目前的成功，以及对肿瘤发生和治疗耐药性的不断了解，将为mRNA技术对抗癌症带来重大进展。期待未来能够有更多的研究结果和临床应用数据，进一步推动mRNA癌症疗法的发展和推广。
END
参考文献：Liu, C., Shi, Q., Huang, X. et al. mRNA-based cancer therapeutics. Nat Rev Cancer (2023).
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