间充质干细胞衍生的细胞外囊泡（MSC-EVs）：下一代治疗工具？

▲图1细胞外囊泡的形成和主要类型：A外泌体来源于内泌体途径，B外泌体的组成

间充质干细胞易于在体外复苏和增殖，使其能够大规模生产用于临床应用。近年来已成为临床应用中研究最多的干细胞类型，并在移植物抗宿主病（GVHD）、肾损伤、组织和器官移植、免疫耐受、神经损伤、风湿病和肝病中发挥了有效的治疗作用。此外，MSC在新冠肺炎大流行背景下引起了广泛关注。有研究者证明在MSC治疗组中，由于调节白细胞介素10（IL-10）表达增加、抑制过度活化的免疫T细胞和NK细胞以及显著降低TNF-α表达水平，这使新冠肺炎感染患者得以治愈或病情显著改善。

尽管MSC疗法具有优势，但仍有一些方面值得考虑。首先，在体外培养过程中，随着传代次数的增加，MSCs的增殖能力逐渐减弱，并伴有一定程度的分化甚至衰老。这影响了它们的调节和治疗能力。其次，在体内环境中，遗传因素和骨髓间充质干细胞的自我更新能力无法控制，从而可能产生致瘤性。此外，尽管间充质干细胞具有强大的再生调节潜力，但尚不确定它们是否能在静脉注射后靶向或留在受损部位。有证据表明，由于宿主的清除能力，只有少量MSC到达靶位点。尽管原位注射可以部分解决这些问题，但细胞分化和衰老仍然存在问题，临床效果不容乐观。MSC还被发现可导致和促进各种类型癌症的生长。此外，还有细胞治疗的常见相关风险，如病毒感染和免疫排斥，以及储存和运输问题。

间充质干细胞的大多数治疗作用取决于其旁分泌作用，EVs可以取代其母细胞，这一发现为研究人员提供了重要的研究思路。EVs具有很大的优势：它们不自我复制，在很大程度上避免了致瘤风险；与细胞治疗相比，EVs更安全，作为纳米颗粒，它们还具有生物相容性和低免疫原性，使它们能够穿过血脑屏障等保护性生物屏障；此外，永生化间充质干细胞还可持续分泌EVs，以获得足够的数量；EVs通过其脂质膜结构保护其内部生物分子活性，可在-80°C下长期保存，即使在反复冻融后也不会失活，而且它们具有封装能力，可以装载特定药物并将其运输到靶细胞，如递送mRNA等。

基于MSC-EVs与多种靶细胞（包括巨噬细胞、小胶质细胞、软骨细胞、内皮细胞、成纤维细胞、周细胞、神经干细胞（NSC）、神经元、肝星状细胞）之间的细胞通讯，MSC-EVs在免疫调节和组织再生方面的治疗潜力已被报道。这里讨论了MSC-EVs在组织修复和抗纤维化中的分子机制，其中几个miRNA簇及其下游途径已被揭示在骨关节炎、脊髓损伤、皮肤损伤、肝纤维化、肾纤维化和肺纤维化中发挥重要作用（表2-7）。

骨关节炎（OA）是关节疾病的主要形式，发病机制尚不清楚，表现为疼痛和僵硬，在某些情况下还可导致残疾。MSC-EVs已被证明在OA中具有再生和免疫调节的作用（表2）。

几项研究报道，hBMSC-EVs通过抑制一些促炎途径和因子，增强软骨细胞的增殖和迁移，在OA的治疗中发挥着重要作用。此外，在OA样软骨细胞中，MSC-EVs诱导II型胶原蛋白和蛋白聚糖（软骨细胞标记物）的表达，同时抑制MMP-13和ADAMTS5（分解代谢）和iNOS（炎症标记物）表达。在OA模型中表明MSC-EVs的作用是由于TGFBI mRNA和蛋白质的存在。在同一模型中，骨髓MSC-EVs促进永生化巨噬细胞RAW264.7从M1向M2的转化，降低促炎细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的表达，并增强IL-10、软骨生成基因、II型胶原和SOX9的表达。在IL-1β存在的情况下，MSC-EVs可以通过增加II型胶原合成和减少MMP-1、MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的表达来改善软骨变性。

最近的多研究也检测了miRNA在MSC-EVs中的作用。在滑膜来源的MSC-EVs（SMSC-EVs）中，过度表达miR-140-5p以阻断Wnt5a和Wnt5b，从而通过Wnt信号通路激活YAP，并显著减少细胞外基质（ECM）分泌。缺氧增加了HIF-1α诱导的bMSC EVs中miR-216a-3p的表达，并通过抑制JAK2/STAT3信号通路使JAK2的下调，促进软骨细胞的增殖、迁移和减少细胞凋亡。这些miRNA和MSC-EVs的组合可以作为OA的潜在治疗方法

脊髓损伤（SCI）是在各种致病因素对其结构和功能造成损害后发生的，随之而来的是脊髓功能障碍，包括运动、感觉和反射功能障碍。由于神经成分的再生能力有限，MSC-EVs最近被视为SCI的一种有前途的临床治疗方法（表3）。

有研究者在动物模型中研究了hBMSC-EV给药，证明抑制凋亡蛋白（Bax）和促炎因子（TNFα和IL 1β），促进抗凋亡蛋白（Bcl-2）、抗炎蛋白（IL 10）和血管生成，还可以改善运动功能。有趣的是，BMSC-EVs介导的周细胞迁移减少与NF-KB P65信号通路的抑制相关，从而削弱血脑屏障（BSCB）。

从机制上讲，hADSC-Evs通过下调TNF-α、IL-6、CD14、CD19、CD68和caspase 3，并上调VEGF、CD31、Ki67、PCNA、和AQP3来实现皮肤损伤修复。hBMSC-EVs通过靶向TGF-β/Smad信号通路抑制TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad4，增加TGF-β3和Smad7的表达，从而改善疤痕形成并促进伤口愈合。

肝纤维化是一个病理的生理过程，是指由于各种致病因素导致肝内结缔组织异常增殖，MSC-EVs被认为是修复肝纤维化的一种新的治疗方法（表5），体内注射hBMSC-Exos被证明可有效缓解CCL4诱导的大鼠肝纤维化并恢复肝功能，miRNA在MSC-EVs中的抗纤维化作用已成为CCL4诱导的大鼠肝纤维化研究的热点。脂肪来源的ADSC-EVs中的miRNA 181-5p过表达已被证明下调转录3（STAT3）和Bcl-2，并激活HST-T6细胞中的自噬，同时肝脏中I型胶原、波形蛋白、a-SMA和纤连蛋白显著减少。

肾纤维化是一个渐进的病理生理过程，在此过程中，肾功能从健康发展到受伤，再发展到损伤，最终丧失功能。越来越多的人使用各种模型研究MSC-EVs治疗肾纤维化（表6）。

在单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠模型中，hUC-MSC-Exos通过酪蛋白激酶1δ（CK1δ）和E3泛素连接酶β-TRCP抑制Yes相关蛋白（YAP），从而改善肾纤维化。还有类似的研究证实hUC-MSC-Exos通过抑制ROS介导的p38 MAPK/ERK信号通路来减轻肾纤维化。乳脂球-表皮生长因子8（MFG-E8）包含在BMSC-EV中，并通过阻断UUO模型中的RhoA/ROCK途径改善肾纤维化。相应地，最近的研究也表明，来自ADSCs的外泌体通过miRNA改善糖尿病肾病（DN）的发展。据报道，在NOD/SCID/IL2RγKO（NSG）小鼠中多次注射HLSC（人肝干细胞）EVs可显著改善肾纤维化和I型胶原的表达。此外，相关基因（Serpina1a、FAS配体、CCL3、TIMP1、MMP3、I型胶原和SNAI1）显著下调，从而减轻DN症状。

肺纤维化特征是成纤维细胞增殖和大量细胞外基质积聚，伴有炎症损伤和组织破坏。正常肺泡组织受损，异常修复导致结构异常。特发性肺纤维化（IPF）主要表现为肺纤维化病变，是一种严重的间质性肺病，可导致肺功能的进行性丧失。IPF的死亡率高于大多数肿瘤，被认为是一种肿瘤样疾病，MSC-EVs已成为肺纤维化的有效治疗方法（表7）。

BMSC外泌体通过免疫调节发挥其治疗作用，在小鼠模型中，BMSC-Exos已被证明可以抑制M1巨噬细胞的产生和促进M2巨噬细胞的增殖，显著改善高氧（HYRX）诱导的支气管肺单核发育不良（BPD）、肺泡纤维化和肺血管重塑。同样，在博来霉素诱导的肺纤维化模型中，BMSC-Exos已被证明通过调节MΦ表型的整个肺失衡来显著逆转纤维化。此外，UC-MSC Exos调节的Wnt5a/BMP信号通路可增强Wnt5a、Wnt11、BMPR2、BMP4和BMP9的表达，并下调β-catenin、Cyclin D1和TGF-β1的表达，在单核细胞系（MCT）诱导的肺动脉高压（PH）大鼠模型中，MSC-Exos可显著改善肺血管重塑和肺纤维化。此外，MSC-EVs可以通过miRNA表达来逆转肺损伤和肺纤维化。如BMSC-EVs中的miR-186抑制SOX4和Dickkopf-1（Dkk1）的表达，从而有效抑制成纤维细胞的发育并减弱IPF。hPMSC-EVs可以携带miR-214-3p并下调ATM/P53/P21信号传导，从而缓解辐射诱导的肺部炎症和纤维化。还有在LPS诱导的急性肺损伤（ALI）小鼠模型，证明MSC-Exos通过转运miR-23a-3p和miR-182-5p来抑制NFκB和Hedgehog通路，从而改善肺损伤和纤维化。

间充质干细胞最常见于骨髓（BMSC）、脂肪（ADSC）、脐带（UCMSC）和其他组织，但很难保证不同来源和不同批次间充质干细胞细胞及其EVs的质量一致性。这严重限制了间充质干细胞及其EVs作为药物的质量控制和管理，并增加了耐药性问题，使得体外和体内功能检测的再现性有限。

在血管生成研究中，比较了BMSC、ADSC和UCMSC衍生的EVs，发现它们可以减少心肌细胞凋亡，促进血管生成，改善心血管功能。值得注意的是，来自ADSCs的EVs刺激心脏保护因子VEGF、bFGF和HGF表达。此外，在两项独立的缺血模型研究中，与ADSC衍生的EVs相比，BMSC衍生的EVs似乎具有更大的血管生成潜力，与对照组相比，内皮细胞数量增加了约4倍。另一项研究表明，来自子宫内膜间充质干细胞的EVs比来自BMSC或ADMSC的EVs导致更高水平的血管生成。

成骨研究中，在两项单独的大鼠颅骨缺损研究中，BMSC-EV治疗使骨体积比对照组增加了四倍，而ADSC-EV使骨体积增加了约1.33倍。另外，BMSC和ADSC衍生的EVs还加速了软骨细胞的增殖、迁移和成骨分化。

为了开发MSC-EVs治疗产品并商业化，需要对原始材料进行质量保证（QA），包括制造MSC时使用的原代细胞。从成人组织大规模生产用于临床试验的EVs仍然存在许多困难，因为专有MSC的培养时间有限，容易老化，并且成本高昂。此外，它们的异质性使得传统的细胞培养在时间和成本方面效率低下。

原始来源的MSCs需要良好、一致和可控的质量，并具有大量增殖和分泌EVs的能力。为了实现这一点，现在已有使用PSC建立了MSC的诱导系统，以克服MSC-EV大规模生产和质量变化的问题。与从传统来源的MSCs相比，来源于相同亲本PSC的MSCs，克服了使用多种来源的MSCs时EV异质性的问题。最近，源自人类多能干细胞（hPSC）的GMP级MSC已用于难治性移植物抗宿主病（GVHD）的临床试验（PRJNA721023，安德森癌症中心）。值得注意的是，hPMSC-EVs的初步治疗效果已在一名皮肤cGVHD患者中报道，静脉注射hPSC-MSC-EVs后，皮肤僵硬和干燥明显改善。基于初步疗效和安全性，启动了一项1期临床研究，以评估BM-MSC衍生EVs在腹部实体器官移植后急性或慢性排斥反应患者中的安全性和有效性（NCT05215288）。hPSC-MSC衍生的EVs可能会大规模促进MSC-EVs的临床应用，因为hPSC-MSC与传统MSC相比具有质量控制和大规模生产优势。

参考文献：Kou, M., Huang, L., Yang, J. et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles for immunomodulation and regeneration: a next generation therapeutic tool?. Cell Death Dis 13, 580 (2022).