上皮癌的工程化T细胞治疗见解

工程化T细胞疗法在B细胞恶性肿瘤中表现出优异的治疗效果，并有望治疗更广泛的癌症。其中五种针对CD19的CAR-T细胞疗法已获得FDA的批准，用于治疗B细胞恶性肿瘤，两种针对B细胞基质抗原（BCMA）的CAR-T细胞疗法用于治疗多发性骨髓瘤。而在HPV相关癌症中，人乳头瘤病毒（HPV）癌蛋白的临床试验为工程化T细胞提供了明确的靶点。用TCR-T细胞靶向E7抗原治疗难治性癌症（包括宫颈癌、外阴癌和肛门癌）的肿瘤消退。此外，最近有报道称，靶向CLDN18.2的CAR-T细胞在胃癌中显示出可控的毒性和临床活性。这些和其他研究的正在指导工程化T细胞疗法的扩大应用和下一代技术的发展。这里将讨论上皮癌细胞治疗的最新进展和未来方向，重点是TCR-T细胞和临床研究。

由于CD19 CAR-T细胞治疗的成功上市及疗效，CARs（一种抗原受体）已经成为重要的工程化T细胞类型。然而，T细胞也可以通过肿瘤抗原特异性TCR工程化以靶向肿瘤，并且基于TCR的方法在多种的实体瘤中表现出了临床活性。CAR和TCR的不同之处决定了它们各自的靶抗原范围、毒性特征和潜在的逃逸机制，CAR通过抗体单链可变片段（scFv）结构域直接与靶抗原结合，并且与抗体一样，可以与细胞外抗原结合，但不能与细胞内抗原结合（图1）。靶点范围很重要，因为许多有潜在的治疗靶点，如驱动突变、病毒癌蛋白和癌症种系（CG）抗原，都位于细胞内。与CARs不同，TCRs通过异二聚体α-β链受体与肿瘤细胞结合，该受体结合人类白细胞抗原（HLA）呈递的靶抗原的肽（图1）。TCR抗原识别系统的优点是它可以靶向由细胞内或细胞外蛋白产生的肽，另一个优点是短靶肽之外的突变（可能预先释放CAR靶点的表面表达）不会影响TCR的表达，因此不能提供肿瘤逃逸的潜在机制。它的缺点是具有HLA限制性，另外可能通过HLA限制性元件或产生HLA肽复合物的抗原处理机制的组分的丢失而发生肿瘤逃逸。CAR和TCR交叉靶向的新技术已经出现，包括识别pHLA复合物的CAR和识别细胞表面抗原的TCR。这些交叉抗原靶向系统可以增强某些低密度的靶向抗原，然而，它们仍然容易受到与它们模仿的受体相同的肿瘤逃逸机制的影响。

▲图1  CAR-T和TCR-T细胞抗原识别和细胞内信号传导的差异

CAR和TCR在如何将激活信号转导到T细胞方面也有所不同，CAR是单链设计蛋白，通过融合激活结构域发出信号，通常来自T细胞刺激和共刺激分子，一个结构域来源于TCR-CD3复合物（例如，CD3ζ链），另一个来自共刺激受体或共刺激受体的组合（例如，4-1BB或CD28）。TCR是异二聚体受体，与天然CD3分子形成复合物，并使用与野生型TCR相同的机制通过天然CD3复合物发出信号（图1）。CARs与TCRs中使用的这些不同的信号结构域可能会极大地影响T细胞功能和毒性。

用于过继细胞转移的治疗性T细胞可以从肿瘤、外周血或骨髓中获得，它们可以通过内源性TCR或工程化TCR靶向癌症抗原。肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）和工程化TCR-T细胞具有明显的优点和缺点。TIL的优点是，它们通常由多种T细胞克隆型组成，因此可以通过不同HLA分子提供的多种抗原攻击肿瘤（图2A，表1）。然而，在上皮癌中，TIL是治疗的一些反应产生了克隆或寡克隆的细胞产物，这些细胞产物是针对特定的肿瘤抗原（如HPV癌蛋白或体细胞突变）产生的。TIL的另一个优点是有可能靶向多种肿瘤抗原，包括未发现的抗原。TIL的缺点是包括T细胞的特异性和亲和力的细胞产物组成是高度可变的，另外TIL的产生需要肿瘤的手术切除，因此细胞产物的制造时间延长。

与TIL治疗相反，工程化TCR-T细胞具有明确的抗原特异性和功能亲和力，无需手术，制造时间更短（图2B，表1）。TCR-T特异性和亲和力至关重要，可以使用最佳TCR对抗原进行靶向，这是与其他免疫治疗方法（包括TIL治疗、治疗性癌症疫苗和检查点阻断）不同的优势。TCR-T细胞的另一个优点可以由具有增殖和治疗潜力的外周血T细胞工程化产生。此外，这些细胞的体外差异可能通过细胞因子、信号通路调节剂和其他培养条件来实现体内最佳功能。工程化TCR-T细胞的缺点是抗原靶向是单克隆的，除非多种不同的工程化TCR-T细胞结合。此外，治疗仅限于具有特定HLA等位基因和靶抗原组合的个体，这缩小了可以治疗的人群。患者体内肿瘤异质性是TCR-T细胞治疗的另一个潜在挑战，因为很少有靶抗原可以均匀的表达在肿瘤当中。

TIL治疗的临床试验表明，细胞疗法可以介导上皮癌的临床活性，包括在治疗HPV相关癌症中的持久肿瘤反应。一项关于TIL治疗转移性宫颈癌症的单中心研究显示，9名患者中有3名患者出现了反应，其中2名患者在一次治疗后8年以上仍有反应。宫颈癌的TIL疗法已被FDA授予突破性治疗名称。

TIL研究的临床和转化研究继续为免疫疗法和细胞治疗的发展提供帮助。从TIL治疗转移性黑色素瘤的研究中得出的一个重要教训是，先前的治疗对细胞治疗反应产生负面影响。在PD-1检查点阻断被普遍使用之前，对101名患者进行的一项单中心研究报告了56%的总有效率（ORR）（36%的部分有效率[PR]和24%完全缓解[CR]率）。然而，最近一项多中心II期试验对66名先前接受PD-1检查点阻断治疗的患者进行了研究，结果令人意外，报告的ORR为36%，CR率为3%。这些发现与一项回顾性研究一致，该研究显示，检查点初始患者的ORR率为56%，PD-1难治性患者占24%（34例CR中的1例），针对靶向治疗难治性病例占21%（19例CR中为0例）。有趣的是，既往接受靶向药物治疗的BRAF V600E/K突变黑色素瘤患者的有效率（21%对比60%）和生存期（9.3对比50.7个月）低于既往未接受靶向治疗的患者，这些数据符合肿瘤治疗原理，即随着治疗线的增加（尤其是在同一类治疗中，如免疫疗法），肿瘤耐药性增加。这些数据的更广泛含义是，过继性T细胞治疗可能需要在早期的治疗中进行，以确定其真正的临床活性，这可以说是最重要的考虑因素。原则上，在细胞治疗中加入免疫检查点阻断是早期细胞系治疗的一种有吸引力的方法，然而，迄今为止可用的临床前和临床数据表明，这种方法的效果有限。其他临床试验正在进行中，预计还会有更多数据。

TIL治疗HPV相关癌症的研究也为免疫疗法中的肿瘤抗原靶向提供了见解。HPV相关癌症持续表达HPV E6和E7癌蛋白，使其成为有吸引力的治疗靶点。在接受TIL治疗的HPV相关癌症患者中，给予具有E6或E7反应性的TIL细胞的频率以及这些细胞在体内的持久性与临床反应相关。然而，靶向癌蛋白的TIL对肿瘤反应的贡献仍然不清楚，因为在CR患者中，HPV特异性TIL是一个亚显性肿瘤抗原反应人群。事实上，显性肿瘤抗原靶向是针对非病毒抗原，如新抗原或CG抗原（图2A）。然而，TCR-T细胞直接靶向HPV抗原可以介导肿瘤反应，表明这些抗原作为治疗靶点的潜力。

已经有大量有关CAR-T和TCR-T细胞的研究，但很少有能产生可控的安全性和可重复的、客观的（即实体瘤反应评估标准）肿瘤反应。这里将从这个角度回顾来自不同实体瘤适应症的一系列靶点的数据。证明上皮癌临床活性的最明确结果来自于用靶向E6或E7蛋白的TCR-T细胞治疗HPV相关癌症。最初针对E6的I/II期试验仅在12名患者中的2名患者中显示出反应。然而，随后针对具有更高功能亲合力细胞的E7的I期试验在12名病人中的6名患者中表现出反应，包括许多病变的完全消退，以及在PD-1和PD-L1耐药肿瘤中的显著反应。与CAR-T细胞治疗血液癌症相比，细胞剂量不受毒性的限制，毒性也不会随着剂量水平的增加而增加，神经毒性和细胞因子释放综合征（CRS）引起的严重不良事件不是临床管理的主要考虑因素。安全地给予了比标准CAR-T细胞剂量高500倍以上的剂量，并确定了1000亿个细胞的最大剂量（基于制造考虑而非毒性）。与CAR-T细胞相比，可以用相对高的细胞剂量安全给药，这是由于肿瘤限制性抗原的靶向性和内源性CD3复合物用于TCR信号传导。这些数据支持了TCR-T细胞治疗可以安全地介导上皮癌的肿瘤消退，为下一代疗法和更广泛的应用奠定了基础。

用于人类给药的TCR-T细胞的临床试验方案和方法各不相同，但在实体瘤中显示出最强活性的研究具有如下所述的共同特征，总结在表2中。其他方法具有优势，可能有效，但较少得到证实。

调节化疗的使用得到了间接证据的支持，包括连续临床试验的结果、动物模型的数据和转化研究结果。环磷酰胺和氟达拉滨是最常用的药物，最常见的环磷酰胺剂量为60 mg/kg。在E7 TCR-T细胞临床试验中，用30或60 mg/kg环磷酰胺预处理观察到肿瘤反应和体内高水平的TCR-T细胞持久性。

早在转移性黑色素瘤的早期研究中，就有高剂量的IL-2与细胞治疗一起使用。然而，其对疗效的贡献仍然未知。已经观察到低至1至3剂量的白细胞介素的临床反应，包括对TIL治疗和TCR-T细胞治疗上皮癌的免疫反应。尽管在最大耐受剂量下给药时有严重毒性，但第一剂白介素通常引起可控制的毒性，不需要转入重症监护室。因此，一般做法是使用高剂量的白细胞介素，目的是提供细胞因子支持，并避免不可控或不可逆的毒性。

上皮癌工程化TCR-T细胞的最佳剂量尚不清楚，也缺乏指导临床试验设计的数据。一些研究观察到不同的细胞剂量引起不同程度的免疫反应，但对最强肿瘤的试验响应数据使用了大量细胞（超过10亿）（表1）。在所有剂量水平下都观察到对E7 TCR-T细胞治疗的反应，其范围从10亿到1000多亿个细胞。每个剂量水平的样本量都很小（n=3），没有观察到剂量和反应之间的相关性，但观察到剂量与TCR-T细胞的持久性之间相关。可以生产和回输高剂量的细胞，这将导致体内TCR-T的高持久性和肿瘤消退。

基于慢病毒、逆转录病毒、转座子、CRISPR和其他技术的平台可用于产生TCR-T细胞用于临床给药。到目前为止，基于逆转录病毒或慢病毒基因转导技术，结合不需要T细胞分离或工程化T细胞富集步骤的简单制造，可以有较高的基因转导效率，并且在体内的持久性很高。在靶向E7蛋白的 TCR-T细胞试验中，转导效率为93%-99%，在最高剂量水平下，输注后约6周，外周血T细胞的体内持久性为85%-94%。E7 TCR-T细胞由体外CD3抗体和IL-2刺激扩增，主要表现为高分化效应或效应记忆表型，并且能够在体内扩增、长期持久和肿瘤消退。结合非病毒基因转移的其他制造细胞产品的方法具有明显的优势，包括更低的成本和更快的载体生成。

实体瘤TCR-T细胞治疗的临床经验印证了治疗靶点对治疗安全性和疗效的关键影响（表3）。在这里将从靶抗原的角度重新审视临床试验数据，并为靶点选择提供经验。

▼表3 实体瘤TCR-T细胞治疗的靶抗原

共有的肿瘤自身抗原在肿瘤和正常组织中都有表达，其中一些在癌症中均匀表达而成为有吸引力的靶点。由于针对CD19和BCMA的治疗在血液病中的疗效，这类抗原是细胞治疗成功的典型代表。不幸的是，在实体瘤中，迄今为止，肿瘤自身抗原的靶向已导致靶向自身免疫的抑制性毒性。实例包括用TCR-T细胞靶向MART或gp100引起的皮肤、眼睛和耳朵毒性；TCR-T细胞靶向癌胚（CEA）的胃肠道毒性；CAR-T细胞靶向ERBB2的心肺毒性；以及CAR-T细胞靶向碳酸酐酶9（CA9）的肝毒性。这些结果强调了靶向毒性的限制，以及挖掘可以安全靶向的抗原和开发区分正常组织和肿瘤的抗原靶向系统的必要性。而另外一些靶向策略具有临床指导意义，靶向前列腺特异性膜抗原（PSMA）的CAR-T治疗观察到前列腺特异性抗原的减少，尽管有时会出现毒性；针对紧密连接蛋白CLDN18.2的CAR-T细胞在28例癌症患者中的16例和9例其他胃肠道肿瘤患者中的2例中显示出与目标PRs相关的临床活性。

癌症种系抗原（Cancer germline antigens，CG），也称癌症-睾丸抗原，来源于胎儿发育过程中表达的基因。这些基因在大多数健康成人组织中被表观遗传学沉默（除了生殖细胞和胎盘滋养细胞）。然而，它们通过 DNA去甲基化可以在多种肿瘤中表达，并可以产生被T细胞识别的肽片段。如 NYESO-1和 MAGE-A蛋白，由X染色体编码，并在几种类型的癌症中表达。用TCR-T细胞靶向CG抗原NY-ESO-1在黑色素瘤和滑膜细胞肉瘤中显示出有益的免疫应答，20名患者中有11名有应答，18名患者中也有11名应答。在一项试验中测试了NY-ESO-1TCR-T对滑膜细胞肉瘤的应答，42名患者中的15名有应答。在一项针对多种肿瘤的临床试验中，MAGE-A3和MAGE-A10的靶向性肿瘤反应也有报道（每种反应都发生在不同类型的癌症中）。不幸的是，在非小细胞肺癌中，反应很少，这可能与异质性抗原表达有关。

靶向CG抗原MAGE-A3的亲和力增强型TCR证明了TCR临床前测试对交叉反应活性的重要性。由HLA-A*02:01转基因小鼠产生的HLA-A*02∶01限制性TCR，通过CDR2α中的氨基酸取代增强亲和力，由于对MAGE-A12的非同一表位的交叉反应，导致致命的神经毒性，该表位在大脑中表达。类似地，由人产生的HLA-A*01:01-限制性TCR和通过对CDR2α的四个氨基酸取代而增强的亲和力由于对titin（一种在心肌中表达的蛋白）的非相同表位的交叉反应性而引起致命的心脏毒性。这些结果突出了未经胸腺选择的TCR固有的自身免疫的潜在风险，这些强调了TCRs对源自人类蛋白质的肽的交叉反应性的临床前测试的重要性。

肿瘤新抗原是一类肿瘤细胞特有的“抗原”，其主要来源是肿瘤细胞基因组的点突变（约占95%）、基因插入敲除以及移码和结构突变（后两者约占5%）。该类抗原的最大特点是肿瘤细胞特有表达，且它正常细胞不表达，如KRAS。已经描述了使用工程化TCR-T细胞靶向每个患者肿瘤的个性化新抗原的复杂系统。这种类型的方法具有潜在的广泛临床应用的优点，但缺点是制造复杂、产品生成缓慢、靶抗原的变异性和治疗性TCR的变异性。

由于病毒抗原在感染或转化组织中的表达受到限制，因此病毒抗原可以成为工程化T细胞的有吸引力的靶点。携带病毒抗原的癌症包括由HPV、乙型肝炎病毒（HBV）、EB病毒和Merkel细胞多瘤病毒诱导的恶性肿瘤。临床数据显示，工程TCR的活性仅可用于通过HPV16 E6或E7癌蛋白靶向HPV相关癌症。这些癌蛋白具有特别好的特征，并且似乎是组成型表达的，具有高度保守的序列（尽管存在一些变异，特别是在E6中）。肝细胞癌可由几种HBV基因型引起，每种基因型都有不同序列和有限共享潜在表位的额外亚型，早期临床试验正在测试靶向HBV病毒抗原的TCR-T细胞治疗的安全性。其他病毒，如EBV，显示出T细胞逃避的多种机制和使靶表位选择复杂化的可变病毒基因表达程序。Merkel细胞多瘤病毒抗原是Merkel细胞癌中有吸引力的靶点，尽管迄今为止公布的数据来自细胞治疗与其他免疫疗法的结合。

对动物模型的研究强调了通过增强T细胞功能（通过控制T细胞分化、转基因插入或缺失）或通过操纵肿瘤微环境来改善T细胞治疗的潜力。然而，与CAR-T细胞的数据相比，从上皮癌细胞治疗的有限可用临床试验数据来看，尚不清楚T细胞功能和肿瘤微环境限制了治疗反应。针对CG抗原和HPV抗原的临床试验的可用数据表明，功能性工程TCR-T细胞在外周血中具有强大的持久性。对HPV相关癌症中TCR-T细胞治疗的研究表明，明显的肿瘤固有基因缺陷主要与抗原处理和干扰素间反应的关键基因有关（途径如图3所示）。尽管数据集很小，在上皮癌的细胞治疗中，一直观察到在免疫相关途径中具有非冗余作用的基因缺陷。1例患者对靶向KRAS G12D的TIL治疗结肠直肠癌有反应，1例患者对于靶向突变型p53的TCR-T细胞治疗乳腺癌症有反应，均描述了HLA缺失导致的获得性耐药。在接受E6治疗的2名患者中，有1人发现了由于HLA缺失引起的原发性耐药性TCR-T细胞显示出治疗耐药性并具有肿瘤双重症状，另一名具有治疗耐药性的患者显示IFNGR1发生突变。类似地，4例对E7 TCR-T细胞治疗具有原发性或所需耐药性的肿瘤中有4例表现出免疫相关的遗传缺陷，发现HLA突变、B2M突变、B2M-拷贝丢失，以及涉及多个基因的复杂拷贝丢失异常。这些发现反映了免疫检查点抑制剂的研究结果，这些抑制剂显示出由于相同途径和基因的遗传缺陷而产生的耐药性。新的发现还指出了肿瘤固有干扰素-γ信号在实体肿瘤对CAR-T细胞治疗反应中的重要性。虽然在已研究的少数几个病例中观察到，但在不同类型的癌症和不同疾病阶段介导细胞治疗抵抗的肿瘤固有基因缺陷的几率尚不明确。研究肿瘤中免疫抗性基因缺陷是确定抗性机制的普遍性和一致性的重要未来方向，这些信息对于下一代治疗策略和预测性靶点的开发至关重要。

上皮癌的TCR-T细胞治疗在HPV相关癌症和其他恶性肿瘤中具有安全性和临床活性。然而，一些证明原理的相同研究揭示了由于免疫编辑和肿瘤内在逃避机制的局限性。疗效的提高可能依赖于早期治疗，在其他诱导对T细胞识别和杀伤的获得性耐药性的基于免疫的治疗之前使用TCR-T治疗。一些抗性机制，如HLA突变或缺失，可以通过多个HLA限制性元件的多克隆靶向来克服。其他如干扰素反应的干扰可能需要新技术来增强T细胞的效力或联合治疗。基于检测T细胞识别和杀死肿瘤所需基因的突变，开发预测性靶点似乎是提高应答率的一个显著策略。扩展到更广泛的癌症在很大程度上取决于确定可以产生免疫反应的安全高效靶点，旨在实现完全的肿瘤消退。或者，区分肿瘤和正常组织的复杂靶向系统可能会使更多的肿瘤相关抗原纳入TCR-T识别的范围。工程化T细胞疗法有望治疗广泛的癌症。对临床试验结果的有根据的评估表明，才刚刚开始认识上皮癌的有效治疗，有大量的创新旨在提高疗效并扩大可治疗癌症的范围，从临床经验中吸取的教训有助于考虑当前的治疗局限性和推进该领域研究的策略。